Difference between revisions of "Team:TUDelft/Experiments"

Revision as of 16:21, 23 September 2019

Sci-Phi 29

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General

Antibiotic Stock Solution
1. Weigh X gram of the antibiotic of interest.
2. Dissolve the antibiotic of interest in milli-Q.
Note: Dissolve in 95% ethanol in case of Chloramphenicol.
DNA Gel Electrophoresis
Protocol for DNA Gel Electrophoresis includes mutagenic chemical such as EtBR, SYBR Safe or another DNA staining. Carry the protocol out in the assigned area and wear gloves.

Gel preparation:
1. Prepare 0.8% (w/v) agarose in TAE/TBE buffer.
2. Heat the gel solution to dissolve the agarose in the microwave. Swirl the solution a few times while heating to ensure that the agarose powder is dissolved. The agarose is dissolved when the solution has bubbles and is clear.
Casting of gel:
1. Pick an appropriate gel stand and gel comb and place in the gel casting stand. Make sure to fasten the stand in place. Perform the next few steps quickly to prevent the gel from solidifying.
2. Spread 15 µl (large stand)/ 4-5 µl (small stand) of SYBRSafe/EtBr on the stand.
3. Pour the gel carefully into the stand. Ensure that 3/4th of the teeth of the comb is submerged in the solution.
4. Allow the gel to solidify for about 30 minutes.
Sample loading:
1. After the gel solidifies, remove the comb carefully and transfer the gel to the gel box filled with TAE/TBE buffer.
2. Cut a strip of parafilm. Spot loading dye on the parafilm (1:5::dye:sample) and add the sample. (E.g. 5µl of sample and 1µl of dye.) Use the pipette to mix the solutions.
3. Load the samples carefully in the slots. Ensure not to poke the gel.
4. Load 3 µl of DNA ladder.
5. Set the voltage to 100 Volt.
6. Run the gel till the DNA has ran 2/3 of the gel which equals approximately 45 minutes.
7. Visualize the gel using GelDsoc.
DNA Gel Purification
Protocol for PCR Clean-Up using Promega Wizard SV Gel Clean-Up System:

Dissolving the Gel Slice:
1. Following electrophoresis, excise DNA band from gel and place gel slice in a 1.5ml microcentrifuge tube.
2. Add 10µl Membrane Binding Solution per 10mg of gel slice. Vortex and incubate at 50–65°C until gel slice is completely dissolved.
Binding of DNA
1. Insert SV Minicolumn into Collection Tube.
2. Transfer dissolved gel mixture or prepared PCR product to the Minicolumn assembly. Incubate at room temperature for 1 minute.
3. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection Tube.
Washing
1. Add 700µl Membrane Wash Solution (ethanol added). Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection Tube.
2. Repeat Step 4 with 500µl Membrane Wash Solution. Centrifuge at 16,000 × g for 5 minutes.
3. Empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute with the microcentrifuge lid open (or off) to allow evaporation of any residual ethanol.
Elution
1. Carefully transfer Minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube.
2. Add 50µl of Nuclease-Free Water to the Minicolumn. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute.
3. Discard Minicolumn and store DNA at 4°C or –20°C.

Gibson Assembly

The Gibson Assembly is based on the protocol provided by New England Biolabs.

Thaw 10µL of 2X Gibson Assembly mastermix on ice.

Add backbone and insert; The recommended ratio is 1:3 mol vector(x) over mol insert(y). Do not exceed the total volume of 10µL.

Component	Volume (µL)
Gibson Assembly Master Mix 2X (NEB)	10
Vector	X
Insert	Y
MilliQ	10 - X - Y

Incubate the assembly reaction at 50°C for 1h.

Ligation

Thaw the ligase buffer on ice

Add the following components together:

Component	Volume (µL)
10X Ligase buffer	2
T4 DNA Ligase	1
DNA vector	X (~100ng)
DNA fragment	Y*
MilliQ	17 - X - Y

* The recommended vector:insert ratio is 1:3 respectively.

Incubate at 4°C for at least 1h. Optimally, incubate overnight at 4 °C.

Nanodrop DNA quantification
1. Use a nanodrop spectrometer to quantify the DNA amount and purity in a DNA purification or extraction sample.
2. Adjust the settings to measure dsDNA at 260nm and impurities at 230 nm and 280 nm.
Note: DNA should have a 260/280 between 1.8-2.0. The sample is contaminated if the value is below 1.8.

PCR

Colony PCR (GoTaq)

Add the following components for a colony PCR in a PCR tube:

Component	Volume (µL)	Final concentration
Gotaq 5X buffer	10	1x
10 mM dNTP’s	1	200µM
Forward Primer	1	200nM
Reverse Primer	1	200nM
Colony*
GoTaq Polymerase (5U/µL)	0.2	20U/mL
Nuclease Free Water	36.8
Total	50

*Pick a colony under aseptic conditions and resuspend it in milliQ water.

Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:

Step	Temperature (°C)	Time
Initial Denaturation	98	150sec
Denaturation	94	60sec
Annealing	T_annealing*	60sec
Extension	72	1min/kb DNA
Repeat 29x the steps denaturation to extension
Final Extension	72	5 min
Hold	4	∞

* T_annealing: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T_m) of the primers. T_annealing=T_m - 5°C.

Check the PCR product on an agarose gel (see DNA electrophoresis protocol)

Phusion PCR

Add the following components for a Phusion PCR in a PCR tube:

Component	Volume (µL)	Final concentration
5X Phusion HF Buffer	10	1x
10 mM dNTP’s	1	200µM
Forward Primer	1	200nM
Reverse Primer	1	200nM
Template DNA (10ng)	X
Phusion Polymerase	0.5	20U/mL
Nuclease Free Water	36.5 - X
Total	50

Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:

Step	Temperature (°C)	Time
Initial Denaturation	98	30sec
Denaturation	98	10sec
Annealing	T_annealing*	15sec
Extension	72	30sec/kb DNA
Repeat 29x the steps denaturation to extension
Final Extension	72	5 min
Hold	20	∞

* T_annealing: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T_m) of the primers. T_annealing=T_m - 5°C.

Check the PCR product on an agarose gel (see DNA electrophoresis protocol)

KOD Extreme PCR

Add the following components for a Kod Extreme PCR in a PCR tube:

Component	Volume (µL)	Final concentration
2x Kod Xtreme Buffer	2	1x
10 mM dNTP’s	2	400µM
Forward Primer	1.5	300nM
Reverse Primer	1.5	300nM
Template DNA (100ng)	X
Kod Polymerase	1
Nuclease Free Water	36.5 - X
Total	50

Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:

Step	Temperature (°C)	Time
Initial Denaturation	94	2min
Denaturation	98	10sec
Annealing	68	30sec
Extension	68	4min
Repeat 29x the steps denaturation to extension
Final Extension	68	7min
Hold	12	∞

Check the PCR product on an agarose gel (see DNA electrophoresis protocol)

PCR Clean-Up
Protocol for PCR Clean-Up using Promega Wizard SV PCR Clean-Up System:

Processing PCR Amplifications:
1. Add an equal volume of Membrane Binding Solution to the PCR amplification.
Binding of DNA
1. Insert SV Minicolumn into Collection Tube.
2. Transfer dissolved gel mixture or prepared PCR product to the Minicolumn assembly. Incubate at room temperature for 1 minute.
3. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection Tube.
Washing
1. Add 700µl Membrane Wash Solution (ethanol added). Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection Tube.
2. Repeat Step 4 with 500µl Membrane Wash Solution. Centrifuge at 16,000 × g for 5 minutes.
3. Empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute with the microcentrifuge lid open (or off) to allow evaporation of any residual ethanol.
Elution
1. Carefully transfer Minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube.
2. Add 50µl of Nuclease-Free Water to the Minicolumn. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute.
3. Discard Minicolumn and store DNA at 4°C or –20°C.
Plasmid Isolation
Protocol for plasmid isolation using Promega PureYield MiniPrep Kit:

Prepare lysate:
1. Pipette 1.5ml of the bacterial culture in an eppendorf tube and centrifuge culture for 30 seconds at maximum speed in a microcentrifuge.
2. Discard the supernatant.
3. Repeat Steps 1 and 2 until the entire inoculum volume has been spun down.
4. Add 600µl of MilliQ water to the cell pellet, and resuspend completely.
5. Add 100µl of Cell Lysis Buffer, and mix by inverting the tube 6 times. The solution should change from opaque to clear blue, indicating complete lysis.
6. Add 350µl of cold (4–8°C) Neutralization Solution, and mix thoroughly by inverting the tube. The sample will turn yellow when neutralization is complete, and a yellow precipitate will form. Invert the sample an additional 3 times to ensure complete neutralization.
7. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 3 minutes.
8. Transfer the supernatant (~900µl) to a PureYield™ Minicolumn. Do not disturb the cell debris pellet. For maximum yield, transfer the supernatant with a pipette.
9. Place the minicolumn into a PureYield™ Collection Tube, and centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 15 seconds or 30 seconds.
10. Discard the flow through, and place the minicolumn into the same PureYield™ Collection Tube.
Wash:
1. Add 200µl of Endotoxin Removal Wash to the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 15 seconds. It is not necessary to empty the PureYield™ Collection Tube.
2. Add 400µl of Column Wash Solution to the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 30 seconds.
Elute:
1. Transfer the minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube, then add 30µl of nuclease free water at neutral pH directly to the minicolumn matrix. Let stand for 1 minute at room temperature.
2. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 15 seconds to elute the plasmid DNA. Cap the microcentrifuge tube, and store eluted plasmid DNA at –20°C.
3. Follow the nanodrop quantification protocol to determine the purity and yield of your plasmid isolation.

Restriction Digestion

Choose the desired enzyme and its required buffer. The CutSmart buffer 10X is used for most NEB restriction enzymes.

Add the following components together:

Component	Volume (µL)
10X CutSmart buffer (NEB)	2
Fragment (~1-2μg)	X
Restriction Enzyme(s)	1/enzyme
MilliQ	18 - X - added reaction enzyme

Incubate for 4 hours at 37 °C.
Inactivate the restriction enzyme(s) by heating to 65 °C for 10 minutes.

Strain Specific

Bacillus Subtillis

Electrocompetent Cells Preparation
1. Dilute an overnight culture of Bacillus subtilis 16-fold in growth medium and grow at 37 °C to an O.D.600 of 0.85-0.95.
2. Cool the cells on ice-water for 10 min. and harvest by centrifugation at 4°C and 5000 x g for 5 min.
3. Wash cells four times in ice-cold electroporation medium.
4. Suspend the cells in 1/40 of the culture volume of the electroporation solution with a cell concentration of 1-1.3 x 1010 cfu/mL.
5. The competent cells can be stored at –80 °C until use with some decrease in transformation efficiency.

Transformation using electroporation

Add 1 µl (50 ng/µl) plasmid DNA to 60 µl of electrocompetent cells. Homogenize by gently mixing with pipette several times. Transfer mixture into a prechilled cuvette. Incubate for 1-1.5 min.
Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.
Electroporation:

mode	Prokaryotes "O"
Voltage (V)	2,100 V
Time constant (τ)	5 ms
No. of pulses (n)	1

Immediately add 1 ml outgrowth medium and incubate for 3 h at 37 °C.
Plate onto selective LB agar plates and incubate overnight at 37 °C.

Escherichia coli
- Chemically Competent Cells Preparation
  The protocol for chemical competent cells has a duration of three days, starting from the preparation of the reagents. Throughout the protocol, it is mandatory to work under aseptic conditions to prevent contamination risks as much as possible.
  1. Prepare the necessary reagents and sterilize the reagents and centrifuge bottles.
  2. Store the CaCl₂ and the CaCl₂ + 15% glycerol stock solution at 4°C for at least 24 h.
  3. Take the strain of interest from the -80°C and store it on ice.
  4. Streak out the desired E. coli strain on LB plate with antibiotic selection marker and incubate at 37°C overnight.
  5. Inoculate one single colony from the overnight grown plate in 10 mL LB medium with antibiotic selection marker overnight at 37°C while shaking at 200 rpm.
  6. Inoculate 10 mL from the overnight grown liquid cell culture in 1 L of LB medium with antibiotic selection marker and grow the inoculated medium at 37°C while shaking at 200 rpm until the OD600 is between 0.4 and 0.6.The OD is measured the first time after 1.5 hours after inoculation. (Important: the OD should not rise above 0.6 in order to obtain good competent cells)
  7. Split the 1 L LB medium with cells into the centrifuge cylinders by weighing them in order to have equal weight distribution during centrifuging. If necessary prepare a counterweight for in the centrifuge.
  8. Harvest the cells by centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm at 4°C and resuspent all of the pellets carefully in 200 mL ice cold CaCl₂. Use an electronic pipet to resuspend the pellet.
  9. Incubate the resuspended cells for 20 minutes on ice.
  10. Harvest the resuspended cells by centrifugation for 5 minutes at 3000 rpm at 4°C, and resuspent the new pellet gently in 100 mL ice cold CaCl₂. Use an electronic pipet to resuspend the pellet.
  11. Incubate the resuspended cells for 1 hour on ice. In the meantime mark approximately 75 1.5 mL Eppendorf tubes and store them on ice.
  12. Harvest the resuspended cells by centrifugation for 5 minutes at 3000 rpm at 4°C, and resuspent the new pellet gently in 10 mL ice cold CaCl₂ + 15% glycerol. Use an electronic pipet to resuspend the pellet.
  13. Aliquot 50 μL into sterile 1.5 mL microfuge tubes and snap freeze with liquid nitrogen. (Since the cells are very fragile, cut the pipettips in order to reduce the stress on the cells.)
  14. Store frozen cells in the -80°C freezer.
  15. Immediately perform a heat shock transformation to determine the transformation efficiency.
- Glycerol Stock
  1. Incubate ~50 µl cells in 5 ml LB and selection marker overnight.
  2. Pipette 1.5 ml in an eppendorf tube and spin down the bacterial culture.
  3. Discard the supernatant.
  4. Repeat step 2 and 3
  5. Resuspend the pellet in 0.9 ml liquid bacterial culture.
  6. Add the liquid bacterial culture from eppendorf tube to cryotube.
  7. Add 0.9 ml 50% glycerol to the cryotube and mix well.
  8. Store at -80°C.
- LB Agar preparation
  1. Dissolve 14.24g LB agar in 400 mL of milli-Q.
  2. Autoclave the LB agar solution.
- Liquid Broth (LB) Medium Preparation
  1. Dissolve 20 g/L Luria Broth (LB) powder in water as described in the instructions provided by the manufacturer.
  2. Autoclave the medium at 121°C to heat sterilize.
  3. Store the sterilised LB medium at room temperature.
- Heat Shock Transformation
  1. Thaw 50 µL of chemical competent cells on ice for 10 minutes.
  2. Add 0.1- 10 ng plasmid DNA or 20 - 50 ng ligate to the competent cells. incubate on ice for 30 minutes.
  3. Heat shock 45 seconds at 42°C.
  4. Incubate 2 minutes on ice.
  5. Add 1 mL LB medium, mix gently.
  6. Incubate 1 hour at 37°C.
  7. Prepare agar plate with the right corresponding antibiotic marker. 25 mL agar with 200 µL of antibiotic stock solution.
  8. Plate 100 µL of cell suspension on the agar plate and grow it overnight at 37°C.

Pseudomonas Putida

Electrocompetent Cells Preparation
1. Inoculate 50 ml standard-1 medium with 7 ml of a fresh overnight culture of Pseudomonas putida. Grow cells at 30 °C to a density of O.D. of 0.8.
2. Harvest by centrifugation.
3. Wash twice with 50 ml ice-cold glycerol, centrifuge.
4. Resuspend cells in 0.8 ml ice-cold glycerol, keep on ice.

Transformation using electroporation

Add 4 µl plasmid DNA (1 µg) to 40 µl of electrocompetent cells. Homogenize by gently mixing with pipette several times. Transfer mixture into a prechilled cuvette.
Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.
Electroporation:

mode	Prokaryotes "O"
Voltage (V)	2,400 V
Time constant (τ)	5 ms

Immediately add 1 ml standard 1-medium. Incubate 2 hours at 30 °C.
Plate cells on selective plates.

Vibrio Natriegens

Electrocompetent Cells Preparation
1. Grow a 10mL culture of V.natriegens cells in BHIv2 overnight.
2. Inoculate 100mL BHIv2 with 1mL of overnight culture.
3. Place in orbital shaker at 37C at 200 rpm until OD600=0.5.
4. Separate culture into two 50mL falcon tubes and place on ice for 15 min.
5. Pellet cells at 6500 rpm for 20 min at 4C.
6. Resuspend cells in 5 mL(each tube, 10 mL total) of electroporation buffer (680 mM sucrose, 7 mM K2HPO4, pH 7).
7. Fill tube to ~35mL of electroporation buffer and invert gently to mix.
8. Centrifuge cells at 6500 rpm for 15 min at 4C.
9. Decant supernatant with a pipette.
10. Wash the cells with electroporation buffer as described above a total of three times.
11. Wash the cells with electroporation buffer as described above a total of three times.
12. After the final wash, resuspend cells in electroporation buffer as to have OD600=16.
13. Aliquot cells at 100 uL each tube and store in -80°C

Transformation using electroporation

Transformation in Vibrio natriegens SGI-DNA Vmax manual

For each transformation reaction,
• Thaw one vial of Electrocompetent cells on ice for 5 minutes.
• Warm one vial of BHIv2 (BHI with v2 salt: 204 mM NaCl, 4.2 mM KCl, and 23.14 mM MgCl2) to room temperature (20°C to 24°C).
• Pre-chill a 0.1-cm electroporation cuvette on ice.
As soon as the electrocompetent cells are thawed, add 10 ng – 100 ng of plasmid DNA (in TE buffer or water only) to the competent cells on ice. Briefly mix by flicking tubes. Note: Add no more than 2 μL of plasmid DNA to the competent cells. Concentrate the plasmid DNA if necessary.
Incubate the DNA and cell mixture on ice for 3–5 minutes.
During incubation, set the following electroporation parameters: 900 V, 25 uF, 200 Ohms, 0.1-cm cuvette. If further optimization is desired, voltage changes in the range of +/- 200V in 50 V increments can be used. Note: These are the optimized electroporation settings for the Gene Pulser® XcellTM Microbial System using a cuvette with a 0.1-cm gap. If other instruments and/or cuvettes are used, you may need to optimize the conditions for best results.
Transfer cells to a chilled cuvette using a pipette. Verify that the cells completely occupy the bottom of the cuvette and that no air remains between walls of the cuvette and the cells.
Transfer the cuvette to the shock pod and perform electroporation.
• Note: Time constants typically range from 3.3–3.7 ms.
Add 500 uL of BHIv2 recovery media to the cuvette immediately after pulse.
Transfor the BHIv2 media and cell mixture to an Eppendorf tube and place in an orbital shaker (250 rpm) at 30°C for 2 hours at to allow recovery of cells and expression of antibiotic resistance marker.
Note: Recovery can be performed at 37°C unless kanamycin is used for selection.
During cell recovery, pre-warm LB-Miller agar plates prepared with antibiotics at the appropriate incubation temperature.

Plating notes
• We recommend incubating plates at 25°C to 30°C overnight.
• For plates containing kanamycin, plates must be incubated at 25°C to 30°C.
• Colonies typically appear after 12–16 hours at 25°C to 30°C and after ~8 hours at 37°C.
• Store agar plates with established VmaxTM Express at room temperature for up to 72 hours. Due to contact inhibition single colonies will remain well-isolated.
• Do not store VmaxTM agar plates at 2–8°C as this can adversely impact propagation and growth.
• For long-term storage, we recommend preparing glycerol stocks with 25% glycerol and storing at −80°C.

Antibiotic	Solid media	Liquid culture
Ampicillin	2-50 µg/mL	2-25 µg/mL
Kanamycin	100 µg/mL	200 µg/mL
Tetracycline	2.5 µg/mL
Chloramphenicol	5–12.5 μg/mL	12.5–25 μg/mL

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                  color: inherit;
              }
              div .protocols {
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                          <a href="#" class="toggle">DNA Gel Purification</a>
                          <div class="inner">
+                            <p> Protocol for PCR Clean-Up using Promega Wizard SV Gel Clean-Up System:
+                            </p>
+                            <br>
+                            <br>
+                            <p> Dissolving the Gel Slice:
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li>
+                                    Following electrophoresis, excise DNA band from gel and place gel slice in a 1.5ml microcentrifuge tube.
+                                </li>
+                                <li>
+                                    Add 10µl Membrane Binding Solution per 10mg of gel slice. Vortex and incubate at 50–65°C until gel slice is completely dissolved.
+                                </li>
+                            </ol>
                              <p>
-                                 Children will automatically close upon closing its parent.
+                                 Binding of DNA
                              </p>
+                            <ol>
+                                <li> Insert SV Minicolumn into Collection Tube. </li>
+                                <li> Transfer dissolved gel mixture or prepared PCR product to the Minicolumn
+                                    assembly. Incubate at room temperature for 1 minute.  </li>
+                                <li> Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert
+                                    Minicolumn into Collection Tube. </li>
+                            </ol>
+                            <p>
+                                Washing
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li> Add 700µl Membrane Wash Solution (ethanol added). Centrifuge at 16,000 × g
+                                    for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection
+                                    Tube. </li>
+                                <li> Repeat Step 4 with 500µl Membrane Wash Solution. Centrifuge at 16,000 × g
+                                    for 5 minutes.</li>
+                                <li> Empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute
+                                    with the microcentrifuge lid open (or off) to allow evaporation of any residual
+                                    ethanol.</li>
+                            </ol>
+                            <p>
+                                Elution
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li> Carefully transfer Minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube. </li>
+                                <li>  Add 50µl of Nuclease-Free Water to the Minicolumn. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute.</li>
+                                <li> Discard Minicolumn and store DNA at 4°C or –20°C.</li>
+                            </ol>
                          </div>
                      </li>
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                          <div class="inner">
                              <p>
-                                 Children will automatically close upon closing its parent.
+                                 The Gibson Assembly is based on the protocol provided by New England Biolabs.
                              </p>
+                            <ol>
+                                <li> Thaw 10µL of 2X Gibson Assembly mastermix on ice. </li>
+                                <li>  Add backbone and insert; The recommended ratio is 1:3 mol vector(x) over mol insert(y). Do not exceed the total volume of 10µL.
+                                    <table id="tabletu">
+                                        <tr>
+                                            <th> Component </th>
+                                            <th> Volume (µL) </th>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Gibson Assembly Master Mix 2X (NEB) </td>
+                                            <td> 10 </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Vector  </td>
+                                            <td> X </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Insert  </td>
+                                            <td> Y </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> MilliQ  </td>
+                                            <td> 10 - X - Y </td>
+                                        </tr>
+                                    </table>
+                                </li>
+                                <li>  Incubate the assembly reaction at 50°C for 1h.</li>
+                            </ol>
                          </div>
                      </li>
@@ Line 161: / Line 244: @@
                          <a href="#" class="toggle">Ligation</a>
                          <div class="inner">
-                             <p>
+                             <ol>
-                                 Children will automatically close upon closing its parent.
+                                <li> Thaw the ligase buffer on ice
-                            </p>
+                                </li>
+                                <li>
+                                    Add the following components together:
+                                    <table id="tabletu">
+                                        <tr>
+                                            <th> Component </th>
+                                            <th> Volume (µL) </th>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> 10X Ligase buffer </td>
+                                            <td> 2 </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> T4 DNA Ligase  </td>
+                                            <td> 1 </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> DNA vector </td>
+                                            <td> X (~100ng) </td>
+                                        </tr>
+                                                                                <tr>
+                                            <td> DNA fragment </td>
+                                            <td> Y* </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> MilliQ  </td>
+                                            <td> 17 - X - Y </td>
+                                        </tr>
+                                    </table>
+                                </li>
+                                <p>
+                                 * The recommended vector:insert ratio is 1:3 respectively.
+                                </p>
+                                <li>
+                                Incubate at 4°C for at least 1h. Optimally, incubate overnight at 4 °C.
+                                </li>
+                            </ol>
                          </div>
                      </li>
@@ Line 188: / Line 315: @@
                                  <div class="inner">
                                      <ol>
-                                    <li>
-                                        Add the following components for a colony PCR in a PCR tube:
-                                    </li>
-                                    <br>
-                                    <table id="tabletu">
-                                         <tr>
+                                         <li>
-                                             <th> Component </th>
+                                             Add the following components for a colony PCR in a PCR tube:
-                                            <th> Volume (µL) </th>
+                                        </li>
-                                            <th> Final concentration </th>
+                                         <br>
-                                         </tr>
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                             <td> Gotaq 5X buffer </td>
-                                            <td> 10 </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 1x </td>
+                                                <th> Component </th>
-                                        </tr>
+                                                <th> Volume (µL) </th>
-                                        <tr>
+                                                <th> Final concentration </th>
-                                            <td> 10 mM dNTP’s  </td>
+                                             </tr>
-                                            <td> 1 </td>
-                                            <td> 200µM </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Gotaq 5X buffer </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 10 </td>
-                                            <td> Forward Primer  </td>
+                                                <td> 1x </td>
-                                            <td> 1 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 200nM </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> 10 mM dNTP’s  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 1 </td>
-                                            <td> Reverse Primer  </td>
+                                                <td> 200µM </td>
-                                            <td> 1 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 200nM </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Forward Primer  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 1 </td>
-                                            <td> Colony*  </td>
+                                                <td> 200nM </td>
-                                            <td> </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Reverse Primer  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 1 </td>
-                                            <td> GoTaq Polymerase (5U/µL)</td>
+                                                <td> 200nM </td>
-                                            <td> 0.2 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 20U/mL </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Colony*  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> </td>
-                                            <td> Nuclease Free Water  </td>
+                                                <td> </td>
-                                            <td> 36.8 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td>  </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> GoTaq Polymerase (5U/µL)</td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 0.2 </td>
-                                            <td> Total  </td>
+                                                <td> 20U/mL </td>
-                                            <td> 50 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td>  </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Nuclease Free Water  </td>
-                                    </table>
+                                                <td> 36.8 </td>
-<br>
+                                                <td>  </td>
-                                    <p>
+                                            </tr>
-                                        *Pick a colony under aseptic conditions and resuspend it in milliQ water.
+                                            <tr>
-                                    </p>
+                                                <td> Total  </td>
+                                                <td> 50 </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
                                          <br>
-                                    <li>
+                                        <p>
-                                    Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
+                                            *Pick a colony under aseptic conditions and resuspend it in milliQ water.
-                                    </li>
+                                        </p>
+                                        <br>
-                                    <table id="tabletu">
+                                        <li>
+                                            Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
+                                        </li>
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                            <th> Step </th>
-                                            <th> Temperature (°C) </th>
-                                            <th> Time </th>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
+                                            <tr>
-                                             <td> Initial Denaturation </td>
+                                                <th> Step </th>
-                                            <td> 98 </td>
+                                                <th> Temperature (°C) </th>
-                                            <td> 150sec </td>
+                                                <th> Time </th>
-                                        </tr>
+                                             </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Denaturation  </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 94 </td>
+                                                <td> Initial Denaturation </td>
-                                            <td> 60sec </td>
+                                                <td> 98 </td>
-                                        </tr>
+                                                <td> 150sec </td>
-                                        <tr>
+                                            </tr>
-                                            <td> Annealing  </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> T<sub>annealing</sub>* </td>
+                                                <td> Denaturation  </td>
-                                            <td> 60sec </td>
+                                                <td> 94 </td>
-                                        </tr>
+                                                <td> 60sec </td>
-                                        <tr>
+                                            </tr>
-                                            <td> Extension  </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 72 </td>
+                                                <td> Annealing  </td>
-                                            <td> 1min/kb DNA </td>
+                                                <td> T<sub>annealing</sub>* </td>
-                                        </tr>
+                                                <td> 60sec </td>
-                                        <tr>
+                                            </tr>
-                                            <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
+                                            <tr>
-                                         <td>  </td>
+                                                <td> Extension  </td>
-                                            <td>  </td>
+                                                <td> 72 </td>
-                                        </tr>
+                                                <td> 1min/kb DNA </td>
-                                        <tr>
+                                            </tr>
-                                            <td> Final Extension </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 72 </td>
+                                                <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
-                                            <td> 5 min </td>
+                                                <td>  </td>
-                                        </tr>
+                                                <td>  </td>
-                                        <tr>
+                                            </tr>
-                                            <td> Hold  </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 4 </td>
+                                                <td> Final Extension </td>
-                                            <td> ∞ </td>
+                                                <td> 72 </td>
-                                        </tr>
+                                                <td> 5 min </td>
+                                            </tr>
-                                    </table>
+                                            <tr>
-                                    <p>
+                                                <td> Hold  </td>
-                                    * T<sub>annealing</sub>: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T<sub>m</sub>) of the primers. T<sub>annealing</sub>=T<sub>m</sub> - 5°C.
+                                                <td> 4 </td>
-                                    </p>
+                                                <td> ∞ </td>
-                                    <li>
+                                            </tr>
-                                        Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
+                                        </table>
+                                        <p>
+                                            * T<sub>annealing</sub>: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T<sub>m</sub>) of the primers. T<sub>annealing</sub>=T<sub>m</sub> - 5°C.
+                                        </p>
+                                        <li>
+                                            Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
                                          </li>
-                                   </ol>
+                                    </ol>
                                  </div>
                              </li>
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                                  <div class="inner">
                                      <ol>
-                                    <li>
+                                        <li>
-                                        Add the following components for a Phusion PCR in a PCR tube:
+                                            Add the following components for a Phusion PCR in a PCR tube:
-                                    </li>
+                                        </li>
-                                    <br>
+                                        <br>
-                                    <table id="tabletu">
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                            <th> Component </th>
-                                            <th> Volume (µL) </th>
-                                            <th> Final concentration </th>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
+                                             <tr>
-                                             <td> 5X Phusion HF Buffer </td>
+                                                <th> Component </th>
-                                            <td> 10 </td>
+                                                <th> Volume (µL) </th>
-                                            <td> 1x </td>
+                                                <th> Final concentration </th>
-                                        </tr>
+                                             </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> 10 mM dNTP’s  </td>
-                                            <td> 1 </td>
-                                            <td> 200µM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Forward Primer  </td>
-                                            <td> 1 </td>
-                                            <td> 200nM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Reverse Primer  </td>
-                                            <td> 1 </td>
-                                            <td> 200nM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Template DNA (10ng)  </td>
-                                            <td> X </td>
-                                             <td> </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Phusion Polymerase </td>
-                                            <td> 0.5 </td>
-                                            <td> 20U/mL </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Nuclease Free Water  </td>
-                                            <td> 36.5 - X </td>
-                                            <td>  </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Total  </td>
-                                            <td> 50 </td>
-                                            <td>  </td>
-                                        </tr>
-                                    </table>
-<br>
-                                    <li>
-                                    Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
-                                    </li>
-                                    <table id="tabletu">
-                                        <tr>
+                                            <tr>
-                                             <th> Step </th>
+                                                <td> 5X Phusion HF Buffer </td>
-                                             <th> Temperature (°C) </th>
+                                                <td> 10 </td>
-                                             <th> Time </th>
+                                                <td> 1x </td>
-                                        </tr>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> 10 mM dNTP’s  </td>
+                                                <td> 1 </td>
+                                                <td> 200µM </td>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Forward Primer  </td>
+                                                <td> 1 </td>
+                                                <td> 200nM </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Reverse Primer  </td>
+                                                <td> 1 </td>
+                                                <td> 200nM </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Template DNA (10ng)  </td>
+                                                <td> X </td>
+                                                <td> </td>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Phusion Polymerase </td>
+                                                <td> 0.5 </td>
+                                                <td> 20U/mL </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Nuclease Free Water  </td>
+                                                <td> 36.5 - X </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Total  </td>
+                                                <td> 50 </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
+                                        <br>
+                                        <li>
+                                            Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
+                                        </li>
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                             <td> Initial Denaturation </td>
-                                            <td> 98 </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 30sec </td>
+                                                <th> Step </th>
-                                        </tr>
+                                                <th> Temperature (°C) </th>
-                                        <tr>
+                                                <th> Time </th>
-                                            <td> Denaturation  </td>
+                                             </tr>
-                                            <td> 98 </td>
-                                            <td> 10sec </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Initial Denaturation </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 98 </td>
-                                            <td> Annealing  </td>
+                                                <td> 30sec </td>
-                                            <td> T<sub>annealing</sub>* </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 15sec </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Denaturation  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 98 </td>
-                                            <td> Extension  </td>
+                                                <td> 10sec </td>
-                                            <td> 72 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 30sec/kb DNA </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Annealing  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> T<sub>annealing</sub>* </td>
-                                            <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
+                                                <td> 15sec </td>
-                                         <td>  </td>
+                                            </tr>
-                                            <td>  </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Extension  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 72 </td>
-                                            <td> Final Extension </td>
+                                                <td> 30sec/kb DNA </td>
-                                            <td> 72 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 5 min </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
-                                        <tr>
+                                                <td>  </td>
-                                            <td> Hold  </td>
+                                                <td>  </td>
-                                            <td> 20 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> ∞ </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Final Extension </td>
+                                                <td> 72 </td>
-                                    </table>
+                                                <td> 5 min </td>
-                                    <p>
+                                            </tr>
-                                    * T<sub>annealing</sub>: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T<sub>m</sub>) of the primers. T<sub>annealing</sub>=T<sub>m</sub> - 5°C.
+                                            <tr>
-                                    </p>
+                                                <td> Hold  </td>
-                                    <li>
+                                                <td> 20 </td>
-                                        Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
+                                                <td> ∞ </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
+                                        <p>
+                                            * T<sub>annealing</sub>: The annealing temperature is dependent on the melting temperature (T<sub>m</sub>) of the primers. T<sub>annealing</sub>=T<sub>m</sub> - 5°C.
+                                        </p>
+                                        <li>
+                                            Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
                                          </li>
-                                   </ol>
+                                    </ol>
                                  </div>
                              </li>
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                                  <div class="inner">
                                      <ol>
-                                    <li>
+                                        <li>
-                                        Add the following components for a Kod Extreme PCR in a PCR tube:
+                                            Add the following components for a Kod Extreme PCR in a PCR tube:
-                                    </li>
+                                        </li>
-                                    <br>
+                                        <br>
-                                    <table id="tabletu">
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                            <th> Component </th>
-                                            <th> Volume (µL) </th>
-                                            <th> Final concentration </th>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
+                                             <tr>
-                                             <td> 2x Kod Xtreme Buffer </td>
+                                                <th> Component </th>
-                                            <td> 2 </td>
+                                                <th> Volume (µL) </th>
-                                            <td> 1x </td>
+                                                <th> Final concentration </th>
-                                        </tr>
+                                             </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> 10 mM dNTP’s  </td>
-                                            <td> 2 </td>
-                                            <td> 400µM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Forward Primer  </td>
-                                            <td> 1.5 </td>
-                                            <td> 300nM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Reverse Primer  </td>
-                                            <td> 1.5 </td>
-                                            <td> 300nM </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Template DNA (100ng)  </td>
-                                            <td> X </td>
-                                             <td> </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Kod Polymerase </td>
-                                            <td> 1 </td>
-                                            <td>  </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Nuclease Free Water  </td>
-                                            <td> 36.5 - X </td>
-                                            <td>  </td>
-                                        </tr>
-                                        <tr>
-                                            <td> Total  </td>
-                                            <td> 50 </td>
-                                            <td>  </td>
-                                        </tr>
-                                    </table>
-<br>
-                                    <li>
-                                    Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
-                                    </li>
-                                    <table id="tabletu">
-                                        <tr>
+                                            <tr>
-                                             <th> Step </th>
+                                                <td> 2x Kod Xtreme Buffer </td>
-                                             <th> Temperature (°C) </th>
+                                                <td> 2 </td>
-                                             <th> Time </th>
+                                                <td> 1x </td>
-                                        </tr>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> 10 mM dNTP’s  </td>
+                                                <td> 2 </td>
+                                                <td> 400µM </td>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Forward Primer  </td>
+                                                <td> 1.5 </td>
+                                                <td> 300nM </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Reverse Primer  </td>
+                                                <td> 1.5 </td>
+                                                <td> 300nM </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Template DNA (100ng)  </td>
+                                                <td> X </td>
+                                                <td> </td>
+                                             </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Kod Polymerase </td>
+                                                <td> 1 </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Nuclease Free Water  </td>
+                                                <td> 36.5 - X </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> Total  </td>
+                                                <td> 50 </td>
+                                                <td>  </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
+                                        <br>
+                                        <li>
+                                            Place the PCR tube in a thermocycler with the following protocol:
+                                        </li>
-                                         <tr>
+                                         <table id="tabletu">
-                                             <td> Initial Denaturation </td>
-                                            <td> 94 </td>
+                                            <tr>
-                                            <td> 2min </td>
+                                                <th> Step </th>
-                                        </tr>
+                                                <th> Temperature (°C) </th>
-                                        <tr>
+                                                <th> Time </th>
-                                            <td> Denaturation  </td>
+                                             </tr>
-                                            <td> 98 </td>
-                                            <td> 10sec </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Initial Denaturation </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 94 </td>
-                                            <td> Annealing  </td>
+                                                <td> 2min </td>
-                                            <td> 68 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 30sec </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Denaturation  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 98 </td>
-                                            <td> Extension  </td>
+                                                <td> 10sec </td>
-                                            <td> 68 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 4min </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Annealing  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 68 </td>
-                                            <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
+                                                <td> 30sec </td>
-                                         <td>  </td>
+                                            </tr>
-                                            <td>  </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Extension  </td>
-                                        <tr>
+                                                <td> 68 </td>
-                                            <td> Final Extension </td>
+                                                <td> 4min </td>
-                                            <td> 68 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> 7min </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Repeat 29x the steps denaturation to extension </td>
-                                        <tr>
+                                                <td>  </td>
-                                            <td> Hold  </td>
+                                                <td>  </td>
-                                            <td> 12 </td>
+                                            </tr>
-                                            <td> ∞ </td>
+                                            <tr>
-                                        </tr>
+                                                <td> Final Extension </td>
+                                                <td> 68 </td>
-                                    </table>
+                                                <td> 7min </td>
-                                       <li>
+                                            </tr>
-                                        Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
+                                            <tr>
+                                                <td> Hold  </td>
+                                                <td> 12 </td>
+                                                <td> ∞ </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
+                                        <li>
+                                            Check the PCR product on an agarose gel <b><a href="#elec">(see DNA electrophoresis protocol)</a> </b>
                                          </li>
-                                   </ol>
+                                    </ol>
                                  </div>
@@ Line 551: / Line 678: @@
                          <a href="#" class="toggle">PCR Clean-Up</a>
                          <div class="inner">
+                            <p> Protocol for PCR Clean-Up using Promega Wizard SV PCR Clean-Up System:
+                            </p>
+                            <br>
+                            <br>
+                            <p>Processing PCR Amplifications:
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li>
+                                    Add an equal volume of Membrane Binding Solution to the PCR amplification.
+                                </li>
+                            </ol>
                              <p>
-                                 Children will automatically close upon closing its parent.
+                                 Binding of DNA
                              </p>
+                            <ol>
+                                <li> Insert SV Minicolumn into Collection Tube. </li>
+                                <li> Transfer dissolved gel mixture or prepared PCR product to the Minicolumn
+                                    assembly. Incubate at room temperature for 1 minute.  </li>
+                                <li> Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert
+                                    Minicolumn into Collection Tube. </li>
+                            </ol>
+                            <p>
+                                Washing
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li> Add 700µl Membrane Wash Solution (ethanol added). Centrifuge at 16,000 × g
+                                    for 1 minute. Discard flowthrough and reinsert Minicolumn into Collection
+                                    Tube. </li>
+                                <li> Repeat Step 4 with 500µl Membrane Wash Solution. Centrifuge at 16,000 × g
+                                    for 5 minutes.</li>
+                                <li> Empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute
+                                    with the microcentrifuge lid open (or off) to allow evaporation of any residual
+                                    ethanol.</li>
+                            </ol>
+                            <p>
+                                Elution
+                            </p>
+                            <ol>
+                                <li> Carefully transfer Minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube. </li>
+                                <li>  Add 50µl of Nuclease-Free Water to the Minicolumn. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 16,000 × g for 1 minute.</li>
+                                <li> Discard Minicolumn and store DNA at 4°C or –20°C.</li>
+                            </ol>
                          </div>
                      </li>
@@ Line 564: / Line 737: @@
                              </p>
-                             Prepare lysate:
+                             <p>Prepare lysate:
+                            </p>
                              <ol>
                                  <li>Pipette 1.5ml of the bacterial culture in an eppendorf tube and centrifuge culture for 30 seconds at maximum speed in a microcentrifuge.  </li>
@@ Line 580: / Line 755: @@
                                  <br>
                              </ol>
-                             Wash:
+                             <p>Wash:</p>
                              <ol><li>Add 200µl of Endotoxin Removal Wash to the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 15 seconds. It is not necessary to empty the PureYield™ Collection Tube. </li>
                                  <li>Add 400µl of Column Wash Solution to the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge for 30 seconds. </li>
                                  <br>
                              </ol>
-                             Elute:
+                             <p>Elute:</p>
                              <ol><li>Transfer the minicolumn to a clean 1.5ml microcentrifuge tube, then add 30µl of nuclease free water at neutral pH directly to the minicolumn matrix. Let stand for 1 minute at room temperature. </li>
                                  Notes: 1. Elution buffer can also be used, but it can interfere with future cloning steps. 2. For large plasmids (>10kb), warm the Elution Buffer to 50ºC prior to elution, and increase elution volume to 50µl. Also incubate the column at room temperature (22–25°C) for 5–10 minutes before proceeding to Step 14.
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                          <a href="#" class="toggle">Restriction Digestion</a>
                          <div class="inner">
-                             <p>
+                             <ol>
-                                Children will automatically close upon closing its parent.
+                            <li>
-                             </p>
+                            Choose the desired enzyme and its required buffer. The CutSmart buffer 10X is used for most NEB restriction enzymes.
+                            </li>
+                            <li>
+                            Add the following components together:
+                                <table id="tabletu">
+                                        <tr>
+                                            <th> Component </th>
+                                            <th> Volume (µL) </th>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> 10X CutSmart buffer (NEB) </td>
+                                            <td> 2 </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Fragment (~1-2μg)  </td>
+                                            <td> X </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Restriction Enzyme(s) </td>
+                                            <td> 1/enzyme </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> MilliQ  </td>
+                                            <td> 18 - X - added reaction enzyme </td>
+                                        </tr>
+                                    </table>
+                            </li>
+                                <li>
+                                Incubate for 4 hours at 37 °C.
+                                </li>
+                                <li>
+                                Inactivate the restriction enzyme(s) by heating to 65 °C for 10 minutes.
+                                </li>
+                             </ol>
                          </div>
                      </li>
@@ Line 617: / Line 831: @@
                  <ul class="inner">
                      <li>
-                         <a href="#" class="toggle">Bacillus Subtillis</a>
+                         <a href="#" class="toggle"><i>Bacillus Subtillis</i></a>
                          <ul class="inner">
@@ Line 623: / Line 837: @@
                                  <a href="#" class="toggle">Electrocompetent Cells Preparation</a>
                                  <div class="inner">
-                                     <p>
+                                     <ol>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         <li>Dilute an overnight culture of Bacillus subtilis 16-fold in growth medium and grow at 37 °C to an O.D.600 of 0.85-0.95.</li>
-                                    </p>
-                                    <p>
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-                                    </p>
-                                </div>
-                            </li>
+                                        <li>Cool the cells on ice-water for 10 min. and harvest by centrifugation at 4°C and 5000 x g for 5 min.</li>
-                            <li>
+                                        <li>Wash cells four times in ice-cold electroporation medium.</li>
-                                <a href="#" class="toggle">Glycerol Stock</a>
-                                <div class="inner">
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
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-                                    </p>
-                                </div>
-                            </li>
-                            <li>
+                                        <li>Suspend the cells in 1/40 of the culture volume of the electroporation solution with a cell concentration of 1-1.3 x 1010 cfu/mL.</li>
-                                <a href="#" class="toggle">LB Agar preparation </a>
-                                <div class="inner">
+                                        <li>The competent cells can be stored at –80 °C until use with some decrease in transformation efficiency. </li>
-                                    <p>
+                                     </ol>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
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-                                     </p>
                                  </div>
                              </li>
@@ Line 662: / Line 853: @@
                              <li>
-                                 <a href="#" class="toggle">Liquid Broth (LB) Medium Preparation </a>
+                                 <a href="#" class="toggle">Transformation using electroporation</a>
                                  <div class="inner">
-                                     <p>
+                                     <ol>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         <li>Add 1 µl (50 ng/µl) plasmid DNA to 60 µl of electrocompetent cells. Homogenize by gently mixing with pipette several times. Transfer mixture into a prechilled cuvette. Incubate for 1-1.5 min.</li>
-                                    </p>
+                                        <li>Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.</li>
-                                    <p>
+                                        <li>Electroporation:</li>
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+                                         <table id="tabletu">
-                                        blandit. In hac habitasse platea dictumst. Sed risus velit, pellentesque eu enim ac, ultricies pretium felis.
+                                            <tr>
-                                    </p>
+                                                <td> <b>mode</b> </td>
-                                </div>
+                                                <td> Prokaryotes "O" </td>
-                            </li>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> <b>Voltage (V)</b> </td>
+                                                <td> 2,100 V </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> <b>Time constant (τ)</b> </td>
+                                                <td> 5 ms </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> <b>No. of pulses (n)</b> </td>
+                                                <td> 1 </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
-                            <li>
-                                <a href="#" class="toggle">Electroporation</a>
+                                        <li>Immediately add 1 ml outgrowth medium and incubate for 3 h at 37 °C.</li>
-                                <div class="inner">
+                                        <li> Plate onto selective LB agar plates and incubate overnight at 37 °C. </li>
-                                    <p>
+                                     </ol>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
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-                                     </p>
                                  </div>
                              </li>
@@ Line 694: / Line 892: @@
                      <li>
-                         <a href="#" class="toggle">Escherichia coli</a>
+                         <a href="#" class="toggle"><i>Escherichia coli</i></a>
                          <ul class="inner">
@@ Line 833: / Line 1,031: @@
                      <li>
-                         <a href="#" class="toggle">Pseudomonas Putida</a>
+                         <a href="#" class="toggle"><i>Pseudomonas Putida</i></a>
                          <ul class="inner">
@@ Line 839: / Line 1,037: @@
                                  <a href="#" class="toggle">Electrocompetent Cells Preparation</a>
                                  <div class="inner">
-                                     <p>
+                                     <ol>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         <li>Inoculate 50 ml standard-1 medium with 7 ml of a fresh overnight culture of Pseudomonas putida. Grow cells at 30 °C
-                                    </p>
+                                            to a density of O.D. of 0.8. </li>
-                                    <p>
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-                                    </p>
-                                </div>
-                            </li>
+                                        <li>Harvest by centrifugation.</li>
-                            <li>
+                                        <li>Wash twice with 50 ml ice-cold glycerol, centrifuge. </li>
-                                <a href="#" class="toggle">Glycerol Stock</a>
-                                <div class="inner">
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
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-                                    </p>
-                                </div>
-                            </li>
-                            <li>
+                                        <li>Resuspend cells in 0.8 ml ice-cold glycerol, keep on ice. </li>
-                                <a href="#" class="toggle">LB Agar preparation </a>
-                                <div class="inner">
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
+                                    </ol>
                                  </div>
                              </li>
@@ Line 875: / Line 1,053: @@
                              <li>
-                                 <a href="#" class="toggle">Liquid Broth (LB) Medium Preparation </a>
+                                 <a href="#" class="toggle">Transformation using electroporation</a>
                                  <div class="inner">
-                                     <p>
+                                     <ol>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         <li>Add 4 µl plasmid DNA (1 µg) to 40 µl of electrocompetent cells. Homogenize by gently mixing with pipette several
-                                    </p>
+                                            times. Transfer mixture into a prechilled cuvette. </li>
-                                    <p>
+                                        <li>Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.</li>
-                                         Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Maecenas tempus placerat fringilla. Duis a elit et dolor laoreet volutpat. Aliquam ultrices mauris id mattis imperdiet. Aenean cursus ultrices justo et varius. Suspendisse aliquam orci id dui dapibus
+                                         <li>Electroporation:</li>
-                                         blandit. In hac habitasse platea dictumst. Sed risus velit, pellentesque eu enim ac, ultricies pretium felis.
+                                         <table id="tabletu">
-                                    </p>
+                                            <tr>
-                                </div>
+                                                <td> <b>mode</b> </td>
-                            </li>
+                                                <td> Prokaryotes "O" </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> <b>Voltage (V)</b> </td>
+                                                <td> 2,400 V </td>
+                                            </tr>
+                                            <tr>
+                                                <td> <b>Time constant (τ)</b> </td>
+                                                <td> 5 ms </td>
+                                            </tr>
+                                        </table>
-                            <li>
+                                        <li>Immediately add 1 ml standard 1-medium. Incubate 2 hours at 30 °C. </li>
-                                <a href="#" class="toggle">Electroporation</a>
+                                        <li> Plate cells on selective plates.</li>
-                                <div class="inner">
+                                     </ol>
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
-                                        Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Maecenas tempus placerat fringilla. Duis a elit et dolor laoreet volutpat. Aliquam ultrices mauris id mattis imperdiet. Aenean cursus ultrices justo et varius. Suspendisse aliquam orci id dui dapibus
-                                        blandit. In hac habitasse platea dictumst. Sed risus velit, pellentesque eu enim ac, ultricies pretium felis.
-                                     </p>
                                  </div>
                              </li>
                          </ul>
@@ Line 908: / Line 1,092: @@
                      <li>
-                         <a href="#" class="toggle">Vibrio Natriegens</a>
+                         <a href="#" class="toggle"><i>Vibrio Natriegens</i></a>
                          <ul class="inner">
@@ Line 914: / Line 1,098: @@
                                  <a href="#" class="toggle">Electrocompetent Cells Preparation</a>
                                  <div class="inner">
-                                     <p>
+                                     <ol>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         <li>Grow a 10mL culture of <i>V.natriegens</i> cells in BHIv2 overnight.</li>
-                                    </p>
+                                        <li> Inoculate 100mL BHIv2 with 1mL of overnight culture.</li>
-                                    <p>
+                                         <li>Place in orbital shaker at 37C at 200 rpm until OD600=0.5.</li>
-                                         Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Maecenas tempus placerat fringilla. Duis a elit et dolor laoreet volutpat. Aliquam ultrices mauris id mattis imperdiet. Aenean cursus ultrices justo et varius. Suspendisse aliquam orci id dui dapibus
+                                        <li>Separate culture into two 50mL falcon tubes and place on ice for 15 min.</li>
-                                         blandit. In hac habitasse platea dictumst. Sed risus velit, pellentesque eu enim ac, ultricies pretium felis.
+                                        <li>Pellet cells at 6500 rpm for 20 min at 4C.</li>
-                                    </p>
+                                        <li>Resuspend cells in 5 mL(each tube, 10 mL total) of electroporation buffer (680 mM sucrose, 7 mM K2HPO4, pH 7).</li>
-                                </div>
+                                         <li>Fill tube to ~35mL of electroporation buffer and invert gently to mix.</li>
-                            </li>
+                                        <li>Centrifuge cells at 6500 rpm for 15 min at 4C.</li>
+                                        <li>Decant supernatant with a pipette.</li>
+                                        <li>Wash the cells with electroporation buffer as described above a total of three times.</li>
+                                        <li>Wash the cells with electroporation buffer as described above a total of three times.</li>
+                                        <li>After the final wash, resuspend cells in electroporation buffer as to have OD600=16.</li>
+                                        <li>Aliquot cells at 100 uL each tube and store in -80°C</li>
+                                    </ol>
-                            <li>
-                                <a href="#" class="toggle">Glycerol Stock</a>
-                                <div class="inner">
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
-                                        Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Maecenas tempus placerat fringilla. Duis a elit et dolor laoreet volutpat. Aliquam ultrices mauris id mattis imperdiet. Aenean cursus ultrices justo et varius. Suspendisse aliquam orci id dui dapibus
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-                                    </p>
                                  </div>
                              </li>
-                            <li>
-                                <a href="#" class="toggle">LB Agar preparation </a>
-                                <div class="inner">
-                                    <p>
-                                        As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
-                                    </p>
-                                    <p>
-                                        Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Maecenas tempus placerat fringilla. Duis a elit et dolor laoreet volutpat. Aliquam ultrices mauris id mattis imperdiet. Aenean cursus ultrices justo et varius. Suspendisse aliquam orci id dui dapibus
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-                                    </p>
-                                </div>
-                            </li>
                              <li>
-                                 <a href="#" class="toggle">Liquid Broth (LB) Medium Preparation </a>
+                                 <a href="#" class="toggle">Transformation using electroporation</a>
                                  <div class="inner">
+                                    <ol>
+                                        <p> Transformation in <i>Vibrio natriegens</i> SGI-DNA Vmax manual</p>
+                                        <li>For each transformation reaction, <br>
+                                            •	Thaw one vial of Electrocompetent cells on ice for 5 minutes. <br>
+                                            •	Warm one vial of BHIv2 (BHI with v2 salt: 204 mM NaCl, 4.2 mM KCl, and 23.14 mM MgCl2) to room temperature (20°C to 24°C). <br>
+                                            •	Pre-chill a 0.1-cm electroporation cuvette on ice.
+                                        </li>
+                                        <li>As soon as the electrocompetent cells are thawed, add 10 ng – 100 ng of plasmid DNA (in TE buffer or water only) to the competent cells on ice. Briefly mix by flicking tubes.
+                                            Note: Add no more than 2 μL of plasmid DNA to the competent cells. Concentrate the plasmid DNA if necessary. </li>
+                                        <li>Incubate the DNA and cell mixture on ice for 3–5 minutes. </li>
+                                        <li>During incubation, set the following electroporation parameters: 900 V, 25 uF, 200 Ohms, 0.1-cm cuvette. If further optimization is desired, voltage changes in the range of +/- 200V in 50 V increments can be used. Note: These are the optimized electroporation settings for the Gene Pulser® XcellTM Microbial System using a cuvette with a 0.1-cm gap. If other instruments and/or cuvettes are used, you may need to optimize the conditions for best results. </li>
+                                        <li>Transfer cells to a chilled cuvette using a pipette. Verify that the cells completely occupy the bottom of the cuvette and that no air remains between walls of the cuvette and the cells. </li>
+                                        <li>Transfer the cuvette to the shock pod and perform electroporation. <br>
+                                            •	Note: Time constants typically range from 3.3–3.7 ms. </li>
+                                        <li>Add 500 uL of BHIv2 recovery media to the cuvette immediately after pulse. </li>
+                                        <li>Transfor the BHIv2 media and cell mixture to an Eppendorf tube and place in an orbital shaker (250 rpm) at 30°C for 2 hours at to allow recovery of cells and expression of antibiotic resistance marker.<br>
+                                            Note: Recovery can be performed at 37°C unless kanamycin is used for selection. </li>
+                                        <li>During cell recovery, pre-warm LB-Miller agar plates prepared with antibiotics at the appropriate incubation temperature.</li>
+                                    </ol>
                                      <p>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         Plating notes<br>
-                                    </p>
+                                        •	We recommend incubating plates at 25°C to 30°C overnight. <br>
-                                    <p>
+                                         •	For plates containing kanamycin, plates must be incubated at 25°C to 30°C. <br>
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+                                        •	Colonies typically appear after 12–16 hours at 25°C to 30°C and after ~8 hours at 37°C. <br>
-                                         blandit. In hac habitasse platea dictumst. Sed risus velit, pellentesque eu enim ac, ultricies pretium felis.
+                                        •	Store agar plates with established VmaxTM Express at room temperature for up to 72 hours. Due to contact inhibition single colonies will remain well-isolated. <br>
-                                     </p>
+                                        •	Do not store VmaxTM agar plates at 2–8°C as this can adversely impact propagation and growth. <br>
-                                </div>
+                                         •	For long-term storage, we recommend preparing glycerol stocks with 25% glycerol and storing at −80°C.
-                            </li>
+                                     </p>
+                                    <table id="tabletu">
-                            <li>
+                                        <tr>
-                                <a href="#" class="toggle">Electroporation</a>
+                                            <th> Antibiotic </th>
-                                <div class="inner">
+                                            <th> Solid media </th>
-                                    <p>
+                                            <th> Liquid culture </th>
-                                         As long as the inner element has inner as one of its classes then it will be toggled.
+                                         </tr>
-                                    </p>
-                                    <p>
+                                        <tr>
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+                                            <td> Ampicillin </td>
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+                                            <td> 2-50 µg/mL </td>
-                                     </p>
+                                            <td> 2-25 µg/mL </td>
+                                         </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Kanamycin</td>
+                                            <td> 100 µg/mL </td>
+                                            <td> 200 µg/mL </td>
+                                        </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Tetracycline  </td>
+                                            <td> 2.5 µg/mL </td>
+                                            <td>  </td>
+                                         </tr>
+                                        <tr>
+                                            <td> Chloramphenicol  </td>
+                                            <td> 5–12.5 μg/mL  </td>
+                                            <td> 12.5–25 μg/mL  </td>
+                                        </tr>
+                                     </table>
                                  </div>
                              </li>