Team:SEFLS Shanghai/Notebook

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Our Original Notes

You can view below our original notes in Chinese.

Day1

按照真菌基因组DNA提取试剂盒提取解脂耶氏酵母和酿酒酵母的基因组；

按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌的基因组；

对提取的基因组进行琼脂糖凝胶电泳。

M：λ-HindIII digest；1：解脂耶氏酵母基因组；2：酿酒酵母基因组。

Day2

以提取的基因组为模板，使用高保真DNA聚合酶对鲨烯合酶YSS、NSS和KSS基因进行PCR；

以基因合成公司送来的含有基因thSQS和crtN的质粒为模板使用高保真DNA聚合酶对基因thSQS和crtN进行PCR；

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证PCR条带正确后进行DNA凝胶回收；

对DNA凝胶纯化产物进行PCR鉴定；

3.YSS; 4.NSS(酿酒酵母); 5.thSQS; 6.KSS(枯草芽孢杆菌)

pETDuet-1质粒进行100μL体系双酶切，37度过夜。

酶切体系

pETDuet-1

30 μL

pETDuet-1

30 μL

10×K

5 μL

10×K

10 μL

BSA(0.1%)

10 μL

none

none

BamHⅠ

5 μL

BamHⅠ

5 μL

NotⅠ

5 μL

HindⅢ

5 μL

ddH2O

45 μL

ddH2O

50 μL

Day3

对pETDuet-1酶切产物进行DNA凝胶回收；

测定pETDuet-1酶切产物和YSS、NSS、KSS、thSQS的DNA凝胶纯化产物的浓度；

按照克隆试剂盒的说明，根据测得的浓度值进行计算，最终确定连接反应体系，进行连接反应；

将连接反应产物对DH5α感受态进行转化。

连接反应体系

 

测定浓度(ng/μL)

最适用量

(ng)

实际添加量

(μL)

pETDuet-1（BamHⅠ/ NotⅠ）

13.1

108.4

8

pETDuet-1 (BamHⅠ/ HindⅢ）

12.8

108.4

8

KSS

60.3

40

1

NSS

130.1

64

0.5

thSQS

109.1

40

0.5

YSS

69.9

60

1

Day4

挑单克隆培养5h后，对基因YSS、NSS、KSS和thSQS进行菌液PCR验证；

对菌液PCR产物进行电泳鉴定，对鉴定正确的阳性转化子进行保种，并取200微升菌液送去测序；

Day6

在液体LB培养基中转接BL21（DE3），为明天制备BL21（DE3）感受态做准备。

Day7

对BL21（DE3）进行感受态制备；

将之前送去测序正确的转化子转接试管，液体LB培养基37度培养过夜；

Day8

进行质粒转化实验，将质粒p35151转入BL21（DE3）感受态；

提取质粒，进行37度过夜双酶切， 为明天连接基因crtN做准备。

Day9

对酶切产物进行DNA凝胶回收；

测定酶切产物和基因crtN的凝胶纯化产物浓度；

按照克隆试剂盒的说明，根据测得的浓度值进行计算，最终确定连接反应体系，进行连接反应，将反应产物保存在-20度；

挑取转化质粒p35151 的BL21（DE3）单克隆，37度过夜培养。

连接反应体系

 

测定浓度(ng/μL)

最适用量

(ng)

实际添加量

(μL)

crtN

112.2

60

0.5

pET-YN

3.5

140

10

pET-NN

4.9

140

10

pET-KN

12.7

130

10

pET-thN

11.7

130

10

Day10

对含有质粒p35151 的BL21（DE3）进行感受态制备；

将昨天的连接反应产物对DH5α感受态进行转化。

Day11

挑单克隆培养5h后，对基因thSQS、KSS、NSS、YSS和crtN进行菌液PCR验证；

对菌液PCR产物进行电泳鉴定，对鉴定正确的阳性转化子进行保种，并取200微升菌液送去测序；

D14

将之前送去测序正确的转化子转接试管，液体LB培养基37度培养过夜；

D15

提取含有不同鲨烯合酶基因和crtN基因的质粒pET-KN、pET-NN、pET-YN和pET-thN；

将提取的以上质粒分别进行转化实验，质粒转入含有p35151 的BL21（DE3）感受态。

D16

每个转化平板上挑3个克隆37℃，250r/min过夜培养；

D17

过夜培养的菌液按10%接种量转入含有3ml TB培养基的试管中，37℃，250 r/min培养至OD600为0.6-0.9，添加终浓度为0.1mM 的IPTG诱导，30℃，180 r/min培养48h。

D18

对菌株N1、N2、N3和N4进行类胡萝卜素提取及检测；

对检测结果进行分析，结果显示鲨烯合酶YSS活性最高；

N1

N2

N3

N4（YSS）

0.003

0.741

0.749

1.175

0.004

0.829

0.959

1.226

0.003

0.522

0.706

1.085

将菌株N4转接试管，37℃培养过夜。

D19

对菌株N4进行30℃和37℃发酵培养

过夜培养的菌液按10%接种量转入含有3ml TB培养基的试管中，37℃，250 r/min培养至OD600为0.6-0.9，添加终浓度为0.1mM 的IPTG诱导，在30℃和37℃两种温度下，180 r/min培养48h。

D21

对在30℃和37℃两种温度下培养的菌株N4进行类胡萝卜素提取及检测；

对检测结果进行分析，结果显示The pigmentation level was very low at 37℃, 因此我们选择30℃为菌株的鲨烯合成发酵温度。

30℃

37℃

1.259

0.036

1.184

0.006

1.155

0.030

D22

将pETDuet-1和pET-YSS分别转化含有 p35151的BL21(DE3)感受态。

D23

转化平板上挑3个克隆转接试管，37℃，250r/min过夜培养；

D24

过夜培养的菌液按10%接种量转入含有20ml TB培养基的摇瓶，37℃，250 r/min培养至OD600为0.6-0.9，添加终浓度为0.1mM 的IPTG诱导，30℃，180 r/min培养96h。

D28

将摇瓶发酵96h后的菌液离心收集，进行鲨烯的提取与HPLC检测

HPLC检测结果：

样品

峰面积

鲨烯产量（mg/L）

1、标品

8688.8

160

2、阴性对照

0.0

0

3、样品1

1179.5

21.7

4、样品2

811.8

14.9

5、样品3

1098.5

20.2

菌株H1的鲨烯产量为 18.9 mg/L

Day29

质粒pET-IAY、pET-IAY-CN、pET-HIAY和pMEP-DG的构建

1、获得目的片段YSS、dxs、ispH、ispG和IIA(rbs-idi-rbs-ispA)

基因dxs、ispH和ispG均从大肠杆菌中PCR获得，IIA片段以质粒p35151为模板PCR获得。

2、分别对骨架载体pBBR1MCS-2、pETDuet-1和pET-YN进行双酶切，pBBR1MCS-2是构建pMEP-DG的骨架，pETDuet-1是构建pET-IAY和pET-HIAY的骨架，而pET-YN是构建pET-IAY-CN的骨架；

3、将酶切回收的质粒骨架和凝胶回收目的片段进行电泳验证

4、将同源重组的片段与对应的骨架载体进行连接反应，反应体系组合如下：

pET-IAY：pET Duet-1酶切产物+IIA+YSS

pET-HIAY： pET Duet-1酶切产物+ispH+IIA+YSS

pET-IAY-CN：pET-YN酶切产物+ IIA+YSS

pMEP-DG：pBBR1MCS-2酶切产物+dxs+ispG

在转化过程中，我们遇到了一些困难，比如平板上长有很多克隆，但是我们获取不到阳性转化子。后来我们通过在PCR产物中添加DpnI酶解决了这个问题，推测可能在准备PCR反应液时，添加的质粒模板浓度过高，从而导致最后平板上长出了过多的阴性转化子。我们还遇到了平板上不长克隆的情况，后来通过提高质粒酶切产物的浓度和稀释片段回收产物的浓度得到解决，推测可能是由于质粒浓度过低或者片段浓度过高都可能影响连接反应体系的准确性，如果添加的质粒和连接的片段不在合适的范围内都有可能导致连接反应的失败。

5、挑取转化平板上的单克隆进行菌液PCR验证，验证结果说明我们成功构建了质粒pET-IAY、pET-IAY-CN、pET-HIAY和pMEP-DG。

Day 30

质粒pMVA1和pMVA2的构建

1、 获得目的片段MVA1（rbs-AtoB-rbs-HMGS-rbs-tHMGR）和MVA2（rbs-MK-rbs-PMK-rbs-PMD-rbs-idi），以p35151为模板。

2、 酶切质粒骨架pBBR1MCS-1-(p15)和pBBR1MCS-2

3、 连接转化

4、 挑单克隆进行菌液PCR验证

Day 31

质粒pUC-IAY和pUC-HIAY构建

1、 获得目的片段IAY（rbs-idi-rbs-ispA-rbs-YSS）和MVA2（rbs-ispH-rbs-idi-rbs-ispA-rbs-YSS），以pET-IAY和pET-HIAY为模板

2、 酶切质粒骨架pUC19；

3、 连接转化

4、 挑单克隆进行菌液PCR验证

Day 32

鲨烯的发酵

对构建的菌株进行96h发酵，发酵数据如下：

菌株H1（mg/L）：21.7 14.9 20.2

菌株H2（mg/L）：63.3 78.9 65.6

菌株H3（mg/L）：64.3 47.4 39.5

菌株H4（mg/L）：326.6 250.7 317.5

菌株H5（mg/L）：537.6 378.2 501.1

菌株H6（mg/L）：650.5 577.9 625.1

菌株H7（mg/L）：921.8 1041.3 959.8

菌株XH3（mg/L）：293.9 280.6 306.3

菌株XH4（mg/L）：395.2 636.76 480.1

菌株XH5（mg/L）：1238.5 1297.2 1287.1