Difference between revisions of "Team:Marburg/Results"

Line 562: Line 562:
 
         <div class="sub-content">
 
         <div class="sub-content">
 
           <div>
 
           <div>
−
             We expanded the Marburg Collection by adding 55 new parts, containing the Green expansion and the first MoClo
+
             We expanded the Marburg Collection by adding the Green expansion and the first MoClo compatible shuttle
−
             compatible shuttle vector for Cyanobacteria.
+
            vector for Cyanobacteria.
 +
          </div>
 +
        </div>
 +
      </div>
 +
      <div id="marburg_collection" class="popup">
 +
        <div class="popup-container">
 +
          <div class="popup-header">
 +
            <h1 class="title">Results</h1>
 +
            <button type="button" onclick="hide('marburg_collection')">X</button> <!--  nummerieren-->
 +
          </div>
 +
          <div class="popup-content" style="text-align: justify;">
 +
            <section class="section">
 +
              <p>
 +
                <b>Results of the Marburg Collection 2.0</b></p><br>
 +
              <p><u>Overview over the expansion of the Marburg Collection:</u></p>
 +
 
 +
 
 +
              <p>We added 55 new parts to the Marburg Collection, adding several new features such as the Green
 +
                expansion,
 +
                including a
 +
                kit for the Modularized Engineering of Genome Areas (M.E.G.A.) and the first MoClo compatible shuttle
 +
                vector for cyanobacteria.
 +
                Additionally, we offer a set of reporters suitable for characterization of BioBricks in cyanobacteria
 +
                and
 +
                ribozymes for a more
 +
                stable and species independent transcription. We also provide standardized measurement vectors that
 +
                were
 +
                generated using our
 +
                designed placeholders.</p><br>
 +
 
 +
 
 +
              <figure style="text-align:center">
 +
                <img style="height: 400px; width: 1000px;"
 +
                  src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/3/3d/T--Marburg--Toolbox_Overview.svg"
 +
                  alt="Overview over the expansion of the Marburg Collection">
 +
                <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                  Fig.1: Overview over the expansion of the Marburg Collection
 +
                </figcaption>
 +
              </figure><br>
 +
 
 +
 
 +
              <p><u>Overview over the different expansions in the Marburg Collection 2.0</u></p>
 +
              <p>To give a better overview we show here the different expansions we added to the Marburg
 +
                Collection:<br>
 +
                <div>
 +
                  <figure style="text-align:center">
 +
                    <img style="height: 400px; width: 600px;"
 +
                      src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/8/87/T--Marburg--constructs1.png" alt="Construct 1">
 +
                    <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                      Fig.2: Construct 1
 +
                    </figcaption>
 +
                  </figure>
 +
 
 +
                  <figure style="text-align:center">
 +
                    <img style="height: 400px; width: 750px;"
 +
                      src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/ef/T--Marburg--constructs2.png" alt="Construct 2">
 +
                    <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                      Fig.3: Construct 2
 +
                    </figcaption>
 +
                  </figure>
 +
 
 +
                  <div style="display: flex; flex-direction: row; justify-content: center;">
 +
                    <figure style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 300px; width: 150px;"
 +
                        src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/f/fc/T--Marburg--constructs3.png" alt="Construct 3">
 +
                      <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                        Fig.4: Construct 3
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <br>
 +
                    <figure style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 300px; width: 150px;"
 +
                        src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/2/21/T--Marburg--constructs4.png" alt="Construct 4">
 +
                      <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                        Fig.5: Construct 4
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
 
 +
                    <figure style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 300px; width: 150px;"
 +
                        src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/e7/T--Marburg--constructs5.png" alt="Construct 5">
 +
                      <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                        Fig.6: Construct 5
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                  </div>
 +
                </div>
 +
 
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Sequencing results of the LVL 0 parts</u></p>
 +
              <p>We built and validated 55 new BioBricks this year. They are all listed in the Registry of Standard
 +
                Biological Parts
 +
                (Part range BBa_3228000 to BBa_32280103). All LVL 0 Parts were validated by complete sequencing.<br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 200px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/d4/T--Marburg--anso-lvl_0_front.jpg"
 +
                    alt="aNSo-lvl-0-front">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.7: aNSo-lvl-0-front
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 200px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/a/ab/T--Marburg--anso_lvl_0_end.jpg" alt="aNSo-lvl-0-end">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.8: aNSo-lvl-0-end
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Building constructs to test the lethality of origin of transfer</u></p>
 +
              <p>If plasmids reach a certain size normal transformation protocols are not feasible anymore to bring
 +
                the
 +
                plasmid into
 +
                the host.<br>
 +
                For the transformation of such huge megaplasmids we designed an “origin of transfer” BioBrick that
 +
                makes
 +
                it possible
 +
                to directly transport plasmids of any size from one species to another. To test if this sequence would
 +
                result in any
 +
                toxicity in a genomic context (source things where genome parts can be exchanged by integrating such
 +
                sequences) we built
 +
                it into an integration vector. For sequencing results see the dropdown menu below.
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Sequencing results of the LVL 1 parts for modularized genome integrations</u></p>
 +
              <p>We successfully build two integration cassettes from our rationally designed artificial neutral
 +
                integration sites
 +
                (a.N.S.o. 1 and 2) and verified them by sequencing. These parts contained the “origin of transfer” to
 +
                test
 +
                their lethality
 +
                in the aforementioned experiment.<br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 200px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/2/2e/T--Marburg--anso_1_mit_Spec_LVL_1.jpg"
 +
                    alt="aNSo1-lvl-1 with spec">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.9: aNSo1-lvl-1 with spec
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 200px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/d6/T--Marburg--anso_2_mit_cml_LVL_1.jpg"
 +
                    alt="anso2-lvl-1 with cml">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.10: anso2-lvl-1 with cml
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Workflow to integrate a modularized integration cassette</u></p>
 +
              <p>We established a workflow on how to integrate a cassette - from LVL 0 Parts to a finished change in
 +
                genome. With
 +
                UTEX 2973 this is possible in less than five days, while in PCC the same integration would take a
 +
                whole
 +
                month.</p><br>
 +
 
 +
 
 +
              <figure style="text-align:center">
 +
                <img style="height: 600px; width: 1800px;"
 +
                  src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/4/41/T--Marburg--Toolbox_Model_ANSOscreening.svg"
 +
                  alt="anso wirkflow">
 +
                <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                  Fig.11: Workflow of integration
 +
                </figcaption>
 +
              </figure><br>
 +
 
 +
 
 +
              <p><u>Using the placeholder to build standard measurement vectors</u></p>
 +
              <p>We successfully used our placeholders to build and validate the standardized measurement vectors for
 +
                promoters,
 +
                ribosomal binding sites and coding sequences. We evaluated the cost and time savings from a library
 +
                assembly with a
 +
                sample size of 25.<br>
 +
                Through our design decision to build placeholders we managed to cut the workload for a high throughput
 +
                assembly by around 72%
 +
                and the invested financial resources by 40 % with just a sample size of 25 assemblies.</p><br>
 +
 
 +
              <div class="wrap-collabsible">
 +
                <input id="collapsibleolol" class="toggle" type="checkbox">
 +
                <label for="collapsibleolol" class="lbl-toggle"> Workload and cost for placeholder</label>
 +
                <div class="collapsible-content">
 +
                  <div class="content-inner">
 +
                    <p>
 +
                      <div>
 +
                        <section style="margin-top: 11vh; padding-bottom: 1.5em;">
 +
                          <h1 class="title">
 +
                            Workload for placeholder
 +
                          </h1>
 +
                          <table class="table is-fullwidth">
 +
                            <thead>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Task</th>
 +
                                <th>Time per sample [min]</th>
 +
                                <th>Samples</th>
 +
                                <th>Total</th>
 +
                              </tr>
 +
                            </thead>
 +
                            <tbody>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Assembly of entry vector (7 part assembly)</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Golden Gate reaction</th>
 +
                                <td>
 +
                                  20
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  20
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Transformation</th>
 +
                                <td>
 +
                                  15
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  15
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Preparing 10 overnight cultures + purification</th>
 +
                                <td>
 +
                                  15
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  10
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  150
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Test digesting</th>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Inserting Promoters (2 part assembly) (25 BioBricks)</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Golden Gate reactions (simplified with a mastermix)</th>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Transformation</th>
 +
                                <td>
 +
                                  10
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  250
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Preparing overnight cultures + purification</th>
 +
                                <td>
 +
                                  15
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  750
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Total</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>1335</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>In hours</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>22,25</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Workflow without placeholders</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>LVL 1 Golden Gate Assembly</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Golden Gate reaction</th>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Transformation</th>
 +
                                <td>
 +
                                  10
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  250
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Preparing 10 overnight cultures + purification</th>
 +
                                <td>
 +
                                  15
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  250
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  3750
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Test digesting</th>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  625
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Total</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>4750</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>In hours</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>79,16666667</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Differences in hours</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>56,91666667</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Percentage saved</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>0,72</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                            </tbody>
 +
                          </table>
 +
                        </section>
 +
                        <section style="margin-top: 11vh; padding-bottom: 1.5em;">
 +
                          <h1 class="title">
 +
                            Cost for placeholder
 +
                          </h1>
 +
                          <table class="table is-fullwidth">
 +
                            <thead>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Major cost point</th>
 +
                                <th>Price [€]</th>
 +
                                <th>Samples</th>
 +
                                <th>Total</th>
 +
                              </tr>
 +
                            </thead>
 +
                            <tbody>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>With placeholder</th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>LVL 1 Golden Gate mix for measurement vector assembly</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsaI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsmbI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Plasmid purification</b></th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  10
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Test digesting</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Enzyme</th>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  5
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Aggarose gel and ladder (approximation)</th>
 +
                                <td>
 +
                                  0,5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  2,5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  1,25
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Sequencing (estimated)</th>
 +
                                <td>
 +
                                  3
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  3
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  9
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>LVL 1 Golden Gate mix for inserting the promoter</b>></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsaI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsmbI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Plasmid purification</b></th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  100
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Sequencing</th>
 +
                                <td>
 +
                                  3
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  150
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Total</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>378,25</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Without placeholder</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>LVL 1 Golden Gate mix for measurement vector assembly</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsaI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>BsmbI</th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  25
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  50
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Plasmid purification</b></th>
 +
                                <td>
 +
                                  2
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  250
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Test digesting</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Enzyme</th>
 +
                                <td>
 +
                                  1
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  125
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Aggarose gel and ladder (approximation)</th>
 +
                                <td>
 +
                                  0,5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  62,5
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  31,25
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th>Sequencing (estimated)</th>
 +
                                <td>
 +
                                  3
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  41,625
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  124,875
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Total</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>378,25</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Difference</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>251,875</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                              <tr>
 +
                                <th><b>Percentage saved</b></th>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
 
 +
                                </td>
 +
                                <td>
 +
                                  <b>0,4</b>
 +
                                </td>
 +
                              </tr>
 +
                            </tbody>
 +
                          </table>
 +
                        </section>
 +
                      </div>
 +
                    </p>
 +
                  </div>
 +
                </div>
 +
              </div>
 +
              <br>
 +
              <p><u>Construction of a promoter library with standard measuring vectors</u></p>
 +
              <p>We built a promoter library using our standard promoter measurement vector and 25 BioBricks.
 +
                Here we show a list of all the BioBricks we used.<br>
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 400px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/3/31/T--Marburg--promoter_library_1.jpg"
 +
                    alt="Promoter library 1r">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.14: Promoter library 1
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 400px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/1/1a/T--Marburg--promoter_library_2.jpg"
 +
                    alt="Promoter library 2">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.15: Promoter library 2
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Workflow for the screen of a BioBrick library</u></p>
 +
              <p>We designed a workflow to build a library, introduce it into UTEX2973 and measure its
 +
                characteristics.<br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 400px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/e3/T--Marburg--Toolbox_MeasurementWorkflow.svg"
 +
                    alt="Measurement-workflow">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.16: Measurement-workflow
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
 
 +
              </p><br>
 +
 
 +
              <p><u>Testing the reproducibility and standard deviation of the screening workflow</u></p>
 +
              <p>We tested how reproducible results from our library screening workflow are with a fluorescence
 +
                reporter.<br>
 +
 
 +
                <figure style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 400px; width: 600px;"
 +
                    src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/f/f0/T--Marburg--results_yfp_pam_4787_6_replicates.jpg"
 +
                    alt="YFP Pam 4787 6 replicates">
 +
                  <figcaption style="max-width: 2400px; text-align: center">
 +
                    Fig.17: YFP Pam 4787 6 replicates
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure><br>
 +
              </p><br>
 +
              <p><u>Application note for the characterization of BioBricks in our chassis</u></p>
 +
              <p>After calibrating our screening procedure, we decided to share our practical knowledge with other end
 +
                users.<br>
 +
 
 +
                <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2019/0/07/T--Marburg--Berthold_Application_Note.pdf">Application
 +
                  Note</a>
 +
              </p>
 +
             </section>
 +
          </div>
 +
        </div>
 +
      </div>
 +
    </section>
 +
  </div>
 +
</div>
 +
 
 +
</html>
 +
{{Marburg/footer}}{{Marburg}}
 +
<html>
 +
<div>
 +
  <div class="box-dark">
 +
    <h1 class="heading">
 +
      R E S U L T S
 +
      <!--  Titel austauschen-->
 +
    </h1>
 +
    <hr class="line">
 +
    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/a/ac/T--Marburg--logo.svg" class="logo" alt="Syntex Logo">
 +
  </div>
 +
  <div style="margin-top: 10vh;">
 +
    <section class="section">
 +
      <h1 class="title"> </h1>
 +
      <p style="text-align: justify;">
 +
        <!--  Text-->
 +
        The way to the results we demonstrate here was full of success and failure. Therefore, it was necessary to
 +
        compare and revise our theoretical plans with the practical work and the associated results. After trying our
 +
        best to implement our plans, we would like to show you on this page that we have managed to realize some of
 +
        our
 +
        goals and are able to show some achievements for every sub-group.
 +
      </p>
 +
    </section>
 +
    <!-- <section class="section">
 +
        <article>
 +
          <h1 class="title"></h1>
 +
          <p style="text-align: justify; margin-bottom: 1em;">
 +
            kein text
 +
          </p>
 +
        </article>
 +
      </section> -->
 +
    <hr>
 +
    <section class="section grid">
 +
      <!--pop up faengt an-->
 +
      <div class="sub" onclick="popup('strain_engineering')">
 +
        <div class="sub-header">
 +
          <h1>
 +
            <!--  Titel von Pop up in schwarzer Box-->
 +
            S T R A I N<br>
 +
            E N G I N E E R I N G
 +
          </h1>
 +
          <hr>
 +
        </div>
 +
        <div class="sub-content">
 +
          <div>
 +
            <!-- Untertitel im Popup -->
 +
            At this page we show how to do genetic modifications
 +
            on <i>S. elongatus</i> UTEX 2973. With these methods we succeed the
 +
            transformation of plasmids in UTEX 2973.
 +
 
 +
          </div>
 +
        </div>
 +
      </div>
 +
      <div id="strain_engineering" class="popup">
 +
        <!-- nummer aendern -->
 +
        <div class="popup-container">
 +
          <div class="popup-header">
 +
            <h1 class="title">Strain engineering</h1> <!--  Titel im pop up-->
 +
            <button type="button" onclick="hide('strain_engineering')">X</button> <!-- nummer aendern -->
 +
          </div>
 +
          <div class="popup-content" style="text-align: justify;">
 +
            <section class="section">
 +
              <!--  Inhalt Pop up start-->
 +
              <h2> <b> Results </b></h2>
 +
              <p>
 +
                <h1></h1>
 +
                <h2>Natural competence</h2>
 +
 
 +
                <p>
 +
                  Reintroducing natural competence into our <i>S. elongatus</i> strain was an important goal for us.
 +
                  To
 +
                  make sure
 +
                  that
 +
                  our <i>S. elongatus</i> UTEX 2973 actually holds the point mutation in the <i>pilN</i> gene we
 +
                  thought
 +
                  it has,
 +
                  we sequenced
 +
                  this region - and the results showed the expected mutation
 +
                  <figure Style="text-align:center">
 +
                    <img style="height: 50ex; width: 90ex"
 +
                      src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/ed/T--Marburg--Seq_UTEX-pilN-with-o_iGEM_1_650.png
 +
                      alt="sequencing results">
 +
                    <figcaption>
 +
                      Fig.1: Sequencing results
 +
                    </figcaption>
 +
                  </figure>
 +
                  <br>
 +
                  As there were multiple methods at hand that we could use to get our strain naturally competent
 +
                  again,
 +
                  we tried
 +
                  all those at hand, making sure we do everything we can to tackle this issue. <br>
 +
                  Although not our favorite method, we tried integrating an intact copy of the <i>pilN</i> gene into
 +
                  neutral site
 +
                  II of
 +
                  <i>S. elongatus</i> UTEX 2973 following the example of <a
 +
                    href=https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.06.002> Li et al., 2018 </a> . We received pSII-trc-pilN,
 +
                    the same plasmid used by Li et al., as a gift from Petra Wurmser from the research group of Prof.
 +
                    Kaldenhoff in Darmstadt and conjugated it into our strain via triparental conjugation. <figure
 +
                    Style="text-align:center">
 +
                    <img style="height: 40ex; width: 50ex"
 +
                      src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/d4/T--Marburg--p_pilN-NSII.png alt="map">
 +
                    <figcaption>
 +
                      Fig. 2: Plasmidmap of pSII-trc-<i> pilN </i>.
 +
                    </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <br>
 +
                    Beforehand, Petra Wurmser told us that she was not able to successfully reproduce the experiment,
 +
                    motivating
 +
                    us
 +
                    to try it ourselves.
 +
 
 +
                    We made sure to follow the protocol in the above mentioned paper, transforming pRL443 and pRL623
 +
                    into E.
 +
                    coli
 +
                    HB101 and pSII-trc-pilN into HB101. Overnight cultures of these cells were inoculated and grown to
 +
                    OD600≈0.5.
 +
                    After washing and incubating them together for half an hour, they were mixed with a exponentially
 +
                    growing
 +
                    <i>S. elongatus</i> culture and incubated for 30 minutes again. Thereafter the mixture was blotted
 +
                    on
 +
                    sterile filters and
 +
                    incubated on BG11 plates for 24h before being transferred onto BG11 plates containing kanamycin
 +
                    <a href=https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.06.002> Li et al., 2018 </a> It is important to add,
 +
                      that we also went with another approach for conjugation: Martina Carrillo Camacho from the working
 +
                      group of Prof. Dr. Tobias Erb provided us with the pRK2013 plasmid, mentioning that she uses it
 +
                      for conjugation. So we transformed the plasmid into <i> E. coli </i> DH5ɑ and
 +
                      pSII-trc-pilN into
 +
                      HB101, performing the
 +
                      same
 +
                      procedure with them as stated above.
 +
                      <br>
 +
                      After a whole week we could actually see growing colonies, though they were only from attempts
 +
                      with the
 +
                      pRK2013 plasmid
 +
                      <figure Style="text-align:center">
 +
                        <img style="height: 50ex; width: 60ex"
 +
                          src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/e5/T--Marburg--Trafo-pilN-NSII-UDAR.jpg alt="map">
 +
                        <figcaption>
 +
                          Fig.3 : Pictures of Agarplates with colonies received from the triparental conjugation with
 +
                          the
 +
                          Helperstrain pRK2013 and HB101, haboring the pSII-trc-pilN Vector.
 +
                        </figcaption>
 +
                      </figure>
 +
                      <br>
 +
 
 +
                      We were still excited, directly starting liquid cultures and
 +
                      running
 +
                      colony PCRs in hope to find our desired result. Although trying a wide variety of primer
 +
                      combinations,
 +
                      we were
 +
                      not able to find any successful integrations, but as the strain was growing on kanamycin and
 +
                      colony PCR
 +
                      does not
 +
                      always work right, we wanted to make sure and tried an actual transformation: a YFP construct
 +
                      was
 +
                      transformed
 +
                      into our seemingly competent strain, allowing for easy selection afterwards. <b>4 Bilder
 +
                        hiernoch
 +
                        rein
 +
                        !</b>
 +
                      Disappointingly we could not transform the strain. This was in accordance to the results of
 +
                      Petra
 +
                      Wurmser, who
 +
                      was also not able to reintroduce natural competence into <i>S. elongatus</i> UTEX 2973 through
 +
                      this
 +
                      method.
 +
                      <br>
 +
                      In hope of better results we decided to try and revert the point mutation in the <i> pilN </i>
 +
                      gene with
 +
                      a CRISPR/Cas system.While still working on the system itself as described in the design section
 +
                      <b>[links to design]</b>, we used
 +
                      the pSL2680 plasmid <a href=https://www.nature.com/articles/srep39681> Ungerer and Pakrasi, 2016
 +
                        </a> to engineer our strain. We followed their protocol <a
 +
                        href=https://www.addgene.org/85581/>(available here on Addgene)</a> to construct a guiding
 +
                        crRNA, leading the Cas12a enzyme to the mutated <i>
 +
                        pilN </i> gene and cloned it together with the enzyme and a repair template to revert the
 +
                        point
 +
                        mutation. Sequencing results of all parts needed were correct, so the final construct could be
 +
                        transformed into our cyanobacteria .<b>[Fig.XX Seq results nicht da ?]</b>
 +
                        In this approach triparental conjugation was performed slightly differently, as we wanted to
 +
                        exactly
 +
                        follow the provided protocol:
 +
                        In contrary to the other method, a HB101 strain harboring pRL623 was again transformed with
 +
                        the
 +
                        plasmid
 +
                        of interest, in this case the fully assembled pSL2680 and the other HB101 strain just
 +
                        contained
 +
                        pRL443.
 +
                        Again, both strains were mixed together and then inoculated before being blotted on filters on
 +
                        BG11
 +
                        plates. This time, after only 6h the filters were transferred on BG11 plates with kanamycin.
 +
                        During our first run a few colonies were visible after just three days, but getting cultures
 +
                        to
 +
                        grow
 +
                        in
 +
                        liquid media did not work as expected and the colonies did not look as healthy as hoped.
 +
                        As we have had this kind of issue several times during our project and saw that in literature
 +
                        the
 +
                        colonies growing on the plates looked differently, we decided to reach out to experienced
 +
                        researchers
 +
                        working with the same Synechococcus elongatus strain. We contacted Prof. Dr. James W. Golden
 +
                        from
 +
                        the
 +
                        University of California, San Diego to ask for advice <b>[link to golden skype call]</b> and
 +
                        were
 +
                        able to
 +
                        discover a crucial difference in the way we work with our strain: while in our own lab this is
 +
                        not
 +
                        commonly done, the researchers from the Golden lab put Na2S2O3 (sodium thiosulfate) in their
 +
                        BG11
 +
                        plates
 +
                        and we could find literature to support this advice (Thiel et al., 1989). This might seem like
 +
                        a
 +
                        small
 +
                        addition, but it proved to be an essential factor, as after adding this ingredient to our own
 +
                        plates
 +
                        we
 +
                        were able to grow way better looking colonies, and not just that - the colonies started coming
 +
                        up
 +
                        after
 +
                        just one day in our incubator
 +
 
 +
                        The reason is simple: When autoclaving agar that contains phosphates, reactive oxygen species
 +
                        such
 +
                        as
 +
                        H2O2 can be formed, which can drastically hinder bacterial growth
 +
                        <a href=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4249246/>(Tanaka et al., 2014)</a>. The
 +
                          thiosulfate from Na2S2O3 is oxidized as H2O2 is reduced to 2 H2O - so clearly thiosulfate can
 +
                          act as a reducing agent, eliminating reactive oxygen species from the medium. Presumably the
 +
                          missing sodium thiosulfate in our BG11 agar was not the sole reason we did not get the desired
 +
                          results on our plate, but in combination with the toxicity of Cas12a (though less toxic than
 +
                          Cas9, it still exhibits nuclease activity, cutting the DNA of the bacteria) the pressure was
 +
                          too high for most of the cells. With our new found ingredient we were certain to get it right
 +
                          this time and set the whole process in motion, this time with BG11 plates including sodium
 +
                          thiosulfate. In one huge experiment we tried a wide variety of different conjugation
 +
                          approaches, following the instructions of multiple papers ( <a
 +
                          href=https://www.nature.com/articles/srep39681> Ungerer and Pakrasi, 2016 </a>, <a
 +
                          href=https://www.nature.com/articles/srep08132>Yu et al., 2015</a> , <a
 +
                          href=https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0514-7>
 +
                          Wendt et al., 2016</a> ). We are currently screening for correct edits and are certain to hold
 +
                          a naturally competent strain in our hands in a matter of days [Fig.XX new plates from Vincas
 +
                          conj]. <figure Style="text-align:center">
 +
                          <img style="height: 50ex; width: 60ex"
 +
                            src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/f/ff/T--Marburg--Conjugation_UTEX2973_pSL2680.png
 +
                            alt="latest conjugation of UTEX2973 with the plasmid pSL2680.">
 +
                          <figcaption>
 +
                            Fig.4 : Latest conjugation of UTEX2973 with the plasmid pSL2680.
 +
                          </figcaption>
 +
                          </figure>
 +
 
 +
                </p>
 +
 
 +
                <h2>CRISPR gene editing</h2>
 +
                <p>CRISPR gene editing
 +
                  Although CRISPR/Cas systems have been discussed as incredibly powerful tools in genetic engineering,
 +
                  they have
 +
                  not yet been widely used in cyanobacterial research, which is why we set out to implement such a
 +
                  system, based
 +
                  on CRISPR/Cas12a, into our Green Expansion of the Marburg Collection <b>[Link to
 +
                    MarburgCollection]</b>.
 +
                  <br>
 +
                  As CRISPR/Cas12a has already been reported to work in <i> S.elongatus</i> UTEX 2973 <a
 +
                    href=https://www.nature.com/articles/srep39681> Ungerer and Pakrasi, 2016 </a>, we were sure that it
 +
                    could be transformed into a Golden Gate Assembly compatible version, allowing for more flexible
 +
                    design considerations <b></b>[Link to Design of CRISPR ]</b>.
 +
                    While we started the cloning processes needed to change the existing vector into the phytobrick
 +
                    standard, we
 +
                    tried the vector at hand ourselves, in order to assess its usefulness.
 +
                    Following the given protocols we constructed a CRISPR/Cas12a vector harboring a crRNA and repair
 +
                    template
 +
                    designed to revert the point mutation in the <i> pilN </i> gene of our <i> S.elongatus</i> strain.
 +
                    After a
 +
                    few
 +
                    initial problems we were able to get conjugants and are currently screening for those containing
 +
                    the
 +
                    desired
 +
                    edit - more on this approach can be found in the Natural Competence section of our results.
 +
                    <br>
 +
                    In order to modularize this system we built different parts for our genetic toolbox. First of all
 +
                    we
 +
                    created
 +
                    a
 +
                    lvl 0 part of the Cas12a protein by amplifying the sequence from the pSL2680 plasmid, including
 +
                    overhangs
 +
                    that
 +
                    enabled us to clone the PCR product into a lvl 0 acceptor vector
 +
 
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 45ex; width: 60ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/a/ae/T--Marburg--Cas12a_CDS_lvl0.png alt="map">
 +
                      <figcaption>
 +
                        Fig. 5: The plasmid map for the coding sequence of the lvl0 construct.
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
 
 +
                    Sequencing results proved, that this crucial part was correctly assembled, ready to be used in lvl
 +
                    1
 +
                    constructs
 +
                    - which we promptly did, using the following lvl 0 parts:
 +
                    pMC0_1_03 + pMC0_2_03 + pMC0_3_07 + pMC0_4_33 + pMC0_5_07 + pMC0_6_17
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 45ex; width: 60ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/a/ae/T--Marburg--Cas12a_CDS_lvl0.png alt="map">
 +
                      <figcaption>
 +
                        Fig. 6: caption: sequencing result of the coding sequence of the Cas12a protein.
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    The chosen promoter is a rather weak one, so that overproduction of Cas12a is prevented, leading
 +
                    to
 +
                    less
 +
                    toxicity in the cells
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 45ex; width: 65ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/7/74/T--Marburg--Cas12a_CDS_lvl1.png alt="map">
 +
                      <figcaption>
 +
                        Fig. 7: The lvl1 construct of the Cas12a protein was built with a weaker promoter to reduce
 +
                        toxic
 +
                        effects.
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <br>
 +
 
 +
                    Having built this construct, we continued to build the other missing part: the crRNA.
 +
                    The design of the pSL2680 plasmid was mostly kept the same, but in order to have an easy and cheap
 +
                    selection
 +
                    method we switched the lacZ cassette with a GFP cassette
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 40ex; width: 90ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/7/7e/T--Marburg--Cas12a_crRNA_lvl0.png
 +
                        alt="m[Fig XX plasmid map of crRNA lvl0]. Through sequencingap">
 +
                      <figcaption>
 +
                        Fig. 8: lvl0 design for the crRNA. The spacer can be exchanged with even more gRNAs to allow
 +
                        for
 +
                        multiplex genome editing.
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <br>
 +
 
 +
 
 +
                    we could show the correct assembly of this part - everything was as we planned in our design
 +
                    <b>[Link to design of CRISPR]</b> meaning that we had all the parts in our MoClo standard.
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 40ex; width: 80ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/3/30/T--Marburg--Cas12a_crRNA_lvl0_seq.png
 +
                        alt="[Fig XX seq results of crRNA lvl0],">
 +
                      <figcaption>
 +
                        Fig. 9: sequencing result of the lvl0 construct of the crRNA
 +
                      </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <br>
 +
                    As the whole system is built for modular cloning in the PhytoBrick syntax, it is possible to
 +
                    freely
 +
                    exchange
 +
                    the
 +
                    parts around the Cas12a and crRNA parts. This enables the use of different promoters, allowing for
 +
                    easy
 +
                    screening: Constructs with weaker promoters in front of the cas12a gene would lead to less gene
 +
                    expression
 +
                    and
 +
                    therefore lower toxicity of the whole system. The free exchange of these promoter parts can
 +
                    consequently be
 +
                    used
 +
                    for the creation of a library in order to look for the perfectly fitting promoter for this system
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
                    Successfully creating these invaluable parts, we were able to establish a workflow for faster
 +
                    cloning in <i>
 +
                      S.elongatus</i>.
 +
                    As our system is modularized, it is possible to easily exchange the GFP cassette for the desired
 +
                    crRNA,
 +
                    which
 +
                    can be done in a single reaction, further simplifying the cloning process of CRISPR/Cas12a
 +
                    constructs.
 +
                    As shown <a href=https://2019.igem.org/Team:Marburg/Design> before</a> , the cloning process with
 +
                      the pSL2680 can take over a week, is tedious work and is accompanied by another couple of days
 +
                      waiting for colonies. In comparison, our system enables for efficient cloning in only four days:
 +
                      On the first day the construct is assembled in a Golden Gate reaction, which is thereafter
 +
                      transformed into E.coli. The next day colonies can be picked, inoculated and the construct can be
 +
                      extracted in the evening. On the third day it can be transformed into <i>
 +
                      S.elongatus</i> -
 +
                      and on the fourth day colonies can be screened.
 +
                      The missing piece to apply an edit is the repair template. Skimming through literature, we
 +
                      noticed
 +
                      that
 +
                      transformation of linear DNA fragments into <i> S.elongatus</i> is supposedly more efficient
 +
                      than
 +
                      the
 +
                      transformation of whole plasmids <a href=https://doi.org/10.1016/j.biori.2017.09.001> (Almeida et
 +
                        al., 2017)</a> - and we were able to verify this fact in our own experiments [Fig XX linear
 +
                        transformation plate pic]. This further simplifies our above mentioned workflow, as we are able
 +
                        to simply PCR the needed repair template from a DNA sequence and use the PCR product for
 +
                        transformation into <i>
 +
                        S.elongatus</i>. Our toolbox has a
 +
                        special feature that can be used for exactly this workflow: a NotI cutting site can be found
 +
                        in
 +
                        our
 +
                        constructs,
 +
                        which is used to linearize them, so that they can be more efficiently transformed.
 +
                        <br>
 +
                        We are more than certain that our modular CRISPR/Cas12a proves to be an invaluable
 +
                        contribution
 +
                        to the
 +
                        tools
 +
                        available in cyanobacterial research, especially for the Golden Gate community, which is
 +
                        growing
 +
                        bigger
 +
                        and
 +
                        bigger every year - also thanks to the iGEM headquarters finally integrating the TypeIIS
 +
                        standard into
 +
                        the
 +
                        competition!
 +
                </p>
 +
 
 +
                <h4>Cyanobacterial shuttle vectors </h4>
 +
 
 +
                <p>As we have already clarified in the description part, self replicating shuttle vectors are
 +
                  essential
 +
                  for
 +
                  many
 +
                  workflows, as the gene expression levels are higher and non of the tedious selection processes that
 +
                  come
 +
                  with
 +
                  genomic integrations have to be done. </p><br>
 +
 
 +
                <p>On our road to the modular vector we were seeking, we firstly cured our own S. elongatus UTEX 2973
 +
                  strain of its
 +
                  pANS plasmid. This was done by transforming the pAM4787 vector, which holds a spectinomycin
 +
                  resistance
 +
                  as well as a
 +
                  YFP cassette
 +
                  <a href=https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.000377> (Chen et al.,
 +
                    2016)</a>. Due to plasmid incompatibility - explained here in our design section <b>[Link to
 +
                    shuttle
 +
                    vector design]</b> - and because antibiotic pressure is applied, the pANS plasmid was over time
 +
                    cured
 +
                    from the
 +
                    strain, which then just kept the pAM4787 plasmid. Transformation was done by conjugation with the
 +
                    pRK2013 plasmid in
 +
                    DH5ɑ and the pAM4787 in HB101. Both were grown to an OD600≈0.5, washed in LB and mixed with S.
 +
                    elongatus which was
 +
                    grown to late exponential phase and then washed in BG11.
 +
                    We could clearly show, that the conjugant strain bears the pAM4787 plasmid if selective pressure
 +
                    is
 +
                    held up.</p>
 +
 
 +
                <figure Style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 65ex; width: 50ex"
 +
                    src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/eb/T--Marburg--YFPconstructConjugantFACS.png
 +
                    alt=" https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/eb/T--Marburg--YFPconstructConjugantFACS.png">
 +
                  <figcaption>
 +
                    Fig. 10: Cell counts of conjugant strain. The y axis shows relative YFP fluorescence and the x
 +
                    axis relative autofluorescence.
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure>
 +
                <p>This was followed by us starting to culture the pAM4787 bearing strain without
 +
                  antibiotics again, slowly removing selective pressure from the cells. As the plasmid does not give
 +
                  them any other
 +
                  advantage and is probably just more metabolic burden due to the constantly produced YFP proteins it
 +
                  is
 +
                  slowly being
 +
                  lost.
 +
                  We could prove this in multiple setups: with the flow cytometry device we were kindly granted access
 +
                  to we could
 +
                  clearly show the missing YFP signal in the cured <i>S. elongatus </i>strain and
 +
                  logically this could also be observed over our UV table.</p>
 +
 
 +
                <figure Style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 65ex; width: 50ex"
 +
                    src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/c/c4/T--Marburg--CuredStrainsFACS.png
 +
                    alt="https://static.igem.org/mediawiki/2019/c/c4/T--Marburg--CuredStrainsFACS.png ">
 +
                  <img style="height: 65ex; width: 50ex"
 +
                    src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/da/T--Marburg--CuredStrainUV.png
 +
                    alt="https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/da/T--Marburg--CuredStrainUV.png">
 +
                  <figcaption> Fig. 11
 +
                    a) Cell counts of cured strain. The y axis shows relative YFP fluorescence and the x axis
 +
                    relative
 +
                    autofluorescence
 +
                    b) Comparison of the fluorescence signal of the transformed (left) and cured (right) strain.
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
                <p>Furthermore we performed colony PCRs as a test. We sent our plasmid-free strain to Next Generation
 +
                  Sequencing in order to ensure that the strain really has lost the
 +
                  pANS plasmid.</p>
 +
                <figure Style="text-align:center">
 +
                  <img style="height: 65ex; width: 50ex"
 +
                    src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/e/e9/T--Marburg--ColonyPCRcuredStrain.jpg alt="gel pcr">
 +
                  <figcaption> Fig. 12: Colony PCR of the wild type, the conjugated and the cured strain.
 +
                  </figcaption>
 +
                </figure>
 +
 
 +
                <p>Our next step was the characterization of the cyanobacterial shuttle vector mentioned in our <a
 +
                    href=https://2019.igem.org/Team:Marburg/Design> design </a> section. In an extensive flow cytometry
 +
                    experiment we assessed the fluorescence of a transformed YFP-construct in our cured strain, showing
 +
                    that the shuttle vector with the minimal replication element can be maintained in<i>S. elongatus
 +
                    </i> UTEX
 +
                    2973. </p><br>
 +
 
 +
                <p>After another four weeks of cultivation we looked at our
 +
                  cultures again on the UV table to check if fluorescence was still present and the high intensity
 +
                  of
 +
                  the fluorescence
 +
                  proved to us, that the plasmid is still stably replicated in our strain, showing us, that the
 +
                  minimal replication
 +
                  element does indeed work in our strain.
 +
                  For further analysis we performed qPCR with this transformed strain, in order to check the copy
 +
                  number of the
 +
                  vector. We used the copy number of pANL as a reference, which is supposedly at ~2,6 copies per
 +
                  chromosome
 +
                  <a href=https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.000377> (Chen et al.,
 +
                    2016)</a>. Our data shows a ~4,5 times higher copy number relative to pANL, meaning that the
 +
                    construct is maintained with approximately 11,7 copies per chromosome.</p> <figure
 +
                    Style="text-align:center">
 +
                    <img style="height: 65ex; width: 50ex"
 +
                      src="https://static.igem.org/mediawiki/2019/d/d6/T--Marburg--Parts--qPCR-Lvl1.png"
 +
                      alt="Copynumber Evaluation of Ori-part via qPCR">
 +
                    <figcaption> Fig. 14: Copynumber Evaluation of Ori-part via qPCR
 +
                    </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
                    <p>Additionally we measured the fluorescence signals in a plate reader at different optical
 +
                      densities
 +
                      and could again
 +
                      confirm high fluorescence signals, indicating strong gene expression in constructs built
 +
                      around
 +
                      this replication
 +
                      element. </p>
 +
                    <figure Style="text-align:center">
 +
                      <img style="height: 55ex; width: 60ex"
 +
                        src=https://static.igem.org/mediawiki/2019/f/f0/T--Marburg--results_yfp_pam_4787_6_replicates.jpg
 +
                        alt="diagramm">
 +
                      <figcaption> Fig. 12:YFP fluorescence at different optical densities. </figcaption>
 +
                    </figure>
 +
 
 +
 
 +
                    <p>All this data confirms that the construct actually works and can be reliably used as a
 +
                      cyanobacterial shuttle
 +
                      vector, proving that BBa_K3228069 works as intended, thus functioning as our validated part.
 +
                      This assumption is solidified by all our sequence data, showing that the shuttle vectors were
 +
                      completely assembled
 +
                      as planned in our design section <b>[Link to design of shuttle vectors]</b>
 +
                      . </p>
 +
                    <br>
 +
                    <br>
 +
                    <!--  Inhalt vom pop up, wenn nur Text dann <p>, wenn mit bilder etc extra ein <div> drum machen-->
 +
            </section> <!--  Inhalt Pop up start-->
 +
          </div>
 +
        </div>
 +
      </div>
 +
      <!--  neues pop nummer 2-->
 +
      <div class="sub" onclick="popup('marburg_collection')">
 +
        <!--  nummerieren-->
 +
        <div class="sub-header">
 +
          <h1>
 +
            M A R B U R G <br> C O L L E C T I O N 2.0
 +
          </h1>
 +
          <hr>
 +
        </div>
 +
        <div class="sub-content">
 +
          <div>
 +
            We expanded the Marburg Collection by adding the Green expansion and the first MoClo compatible shuttle
 +
            vector for Cyanobacteria.
 
           </div>
 
           </div>
 
         </div>
 
         </div>

Revision as of 11:53, 8 December 2019

R E S U L T S

The way to the results we demonstrate here was full of success and failure. Therefore, it was necessary to compare and revise our theoretical plans with the practical work and the associated results. After trying our best to implement our plans, we would like to show you on this page that we have managed to realize some of our goals and are able to show some achievements for every sub-group.

S T R A I N
E N G I N E E R I N G

At this page we show how to do genetic modifications on S. elongatus UTEX 2973. With these methods we succeed the transformation of plasmids in UTEX 2973.

M A R B U R G
C O L L E C T I O N 2.0

We expanded the Marburg Collection by adding the Green expansion and the first MoClo compatible shuttle vector for Cyanobacteria.

R E S U L T S

The way to the results we demonstrate here was full of success and failure. Therefore, it was necessary to compare and revise our theoretical plans with the practical work and the associated results. After trying our best to implement our plans, we would like to show you on this page that we have managed to realize some of our goals and are able to show some achievements for every sub-group.

S T R A I N
E N G I N E E R I N G

At this page we show how to do genetic modifications on S. elongatus UTEX 2973. With these methods we succeed the transformation of plasmids in UTEX 2973.

M A R B U R G
C O L L E C T I O N 2.0

We expanded the Marburg Collection by adding the Green expansion and the first MoClo compatible shuttle vector for Cyanobacteria.