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Latest revision as of 02:24, 16 October 2019

2019.5

We synthesized:

promoter TEF1 and terminator CYC1,  hexa-His gene

promoter GPM1 and terminator TDH1,  nixA gene

promoter TDH3 and terminator PGK1,  TgMTP1t2 gene

promoter TEF2 and terminator ENO2,   kanR gene

Each set of promoter terminators corresponds to a target gene.

GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGCCTTACTAGTAGCGGCCG

GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCAG

GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCAG

GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCAG

GGTCTCAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGAGATTCCCTAGTATCTTCACCGCCGTCTTGTTCGCTGCTAGTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACCACCGAAGACGAAACCGCTCAGATCCCAGCTGAAGCCGTCATCGGTTACCTTGACCTTGAGGGTGACTTCGATGTCGCCGTCCTTCCATTCTCTAACAGTACCAACAACGGTCTTTTGTTCATTAACACCACCATTGCTTCTATCGCCGCTAAGGAGGAGGGTGTCTCTCTTGACAAGAGACATCACCACCACCATCACAGTGCTAAGTCTAGTTTCATCTCTACCACCACTACCGACCTTACCTCTATCAACACCAGTGCCTACAGTACCGGTTCTATCTCTACCGTCGAAACCGGAAACAGAACCACCTCTGAGGTCATCTCTCATGTCGTCACCACCTCTACCAAGCTTAGTCCTACCGCCACCACCAGTCTTACCATCGCTCAAACTTCTATTTATAGTACCGACTCTAATATTACCGTCGGTACCGACATCCACACCACCAGTGAAGTCATCTCTGACGTCGAAACCATCTCTAGGGAAACCGCCTCTACCGTTGTTGCCGCCCCAACTTCTACCACTGGTTGGACCGGTGCCATGAACACTTACATCTCTCAATTCACTTCTTCTAGTTTTGCTACTATTAACTCTACCCCTATCATCTCTTCTAGTGCCGTCTTCGAAACCAGTGACGCCTCTATCGTCAACGTCCATACCGAGAACATCACCAACACTGCTGCCGTTCCATCTGAGGAGCCTACCTTCGTCAACGCCACTAGAAACTCTCTTAATTCTTTTTGTTCTTCTAAACAACCATCTTCTCCTAGTTCTTATACTTCTTCTCCTTTGGTTTCTTCTTTGTCTGTTTCTAAGACCTTGTTGTCTACCTCTTTCACCCCTTCTGTCCCAACTTCTAATACTTATATTAAGACCAAGAACACTGGTTACTTCGAGCACACTGCCTTGACCACCTCTAGTGTTGGATTGAATAGTTTCTCTGAAACCGCCGTCTCTAGTCAAGGTACCAAGATTGACACCTTTTTGGTTTCTAGTTTGATCGCCTACCCATCTTCTGCCTCTGGTTCTCAGCTTAGTGGTATCCAGCAAAATTTTACCTCTACTTCTTTGATGATCAGTACCTACGAGGGTAAGGCCAGTATCTTCTTCTCTGCCGAGTTGGGTTCTATTATTTTTTTGTTGCTTAGTTATTTGTTGTTTTAAAACGGGTACTGTACAGTTAGTACATTGAGTCGAAATATACGAAATTATTGTTCATAATTTTCATCCTGGCTCTTTTTTTCTTCAACCATAGTTAAATGGACAGTTCATATCTTAACTCTAATAATACTTTTCTAGTTCTTATCCTTTTCCGTCTCACCGCAGATTTTATCATAGTATTAAATTTATATTTTGTTCGTAAAAAGAAAAATTTGTGAGCGTTACCGCTCGTTTCATTACCCGAAGGCTGTTTCAGTAGACCACTGATTAAGTAAGTAGATGAAAAAATTTCATCACCATGAAAGAGTTCGATGAGAGCTACTTTTTCAAATGCTTAACAGCTAACCGCCATTCAATAATGTTACGCTCTCTTCATTCTGCGGCTACGTTATCTAACAAGAGGTTTTACTCTCTCATATCTCATTCAAATAGAAAGAACATAATCAAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGAGACC

GGTCTCACAAACACACATATTACAATAGGATCCATGATTAAGTACCATGTCATGAAAGAAGGTTACATCTTGACTGTTTTTAAAAATGAAAGGTTGAGTTGGTTGCCATATATCGCCATCGTCATTTTGTTGCACGTTATTGGTTTCTCTTTCTTGTGGATCGCCGGTAAGGACCATCACATTTTGTTCGGTATGGGTATCCTTGCCTACACTCTTGGTTTGAGGCATGCCTTTGATGCCGACCATATCGCCGCTATCGACAACACCGTTAGAAAGTTGTTGCAGCAGAGAAAGGACCCATCTGGTGTCGGTTTCTACTTCTCTATTGGACATTCTTCTGTCGTCTTCTTGATGGCCGTTTTCCTTGGTGTCTCTGTCAAGTGGGCCAAGGACGAACTTCCTCACTTCCAAGATATCGGAGGTACCATTGGAACCCTTGTTTCTGGTTTTTTCTTGGTTCTTATTGGAGTTCTTAATCTTATTATTCTTATTTCTTTGATTAACTTGTTCGCCAAGTTGAGGAGGGAACACATCGAAGAAGCTGAGGTCGATGCCTTGTTGGAGTCTAGGGGTCTTGTCTCTAGGTTCGTCGGACCATACTTTAAGTTGATCACCAGAAGTTGGCACGTCTTGCCTCTTGGATTCCTTTTCGGATTGGGATTCGACACCGCTTCTGAGATCGCCTTGCTTGCCCTTAGTAGTGGAGCCTCTCAGCAAGCTATCTCTTTCATTGGTATTTTGTCTTTGCCTATCTTGTTCGCCAGTGGTATGAGTCTTCTTGACACCCTTGACGGTGTCGTCATGAAGTACGCCTACAACTGGGCCTTCTTCAACCCTATCAGAAAAATCTATTACAACATTACCATTACCGCCATCTCTGTTATGGCCGCCCTTGTTATCGGTATGATCGAATTGCTTCAAATTCTTGCCGACAAACTTGACTTGCATGGAGCCTTCTGGGCCTTCATTGGAAGTATCGAGTTCGATTATTTGGGTTATATCTTGGTTGCCTTGTTTCTTATTACTTGGTTGATCAGTTCTTTGATTTGGAAATTTGGAAGAATTGAACACAAATGGAGTAGATAAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGAGAGACC

GGTCTCAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATGGAGAGTTCTTCTCATATTATTGAAGTCAACGGAGGTAGATCTGACGAGGAAAGAAGGGCTGTCGCTAGTAAGGTCTGCGGAGAAGCTCCTTGCGGTTTCAGTGACGCTAAGAACGCTTCTGGTGACGCCCAAGAAAGGAACGCCTCTATGAGGAAATTGTGCATCGCCGTCGTCTTGTGCCTTGTCTTCATGTCTGTCGAGGTCGTTGGTGGTGTCAAGGCCAACAGTTTGGCCATCATGACCGATGCCGCTCATCTTTTGAGTGACGTTGCCGCTTTCGCCATCTCTTTGTTCAGTCTTTGGGCTGCCGGTTGGGAGGCTACCCCAAGGCACACCTACGGATTCTTCAGAATCGAAATTCTTGGAGCTCTTGTTTCTATCCAATTGATTTGGTTGCTTACTGGTATCCTTGTTTACGAGGCCATCATTAGACTTTTGACCGAAACCTCTGAGGTCAACGGTTTCTTGATGTTCGCTGTCGCCACTTTCGGTTTGCTTGTCAACATTATCATGGCTGTCATGCTTGGTCACGACCATGACAATGGTCACGGTCATAGTCACGGTGAGGACAAACACGATGAAGCCCATGGTGACGTCACTGAACAGCTTCTTGAAAAGCCAAAACAGCAGAAGGAAAAAAAGAAGAGGAACATCAACGCCCAAGGTGCCTATTTGCACGTCTTGGGTGACTCTATCCAGTCTGTCGGAGTCATGATCGGTGGTGCTGCTATCTGGTACAATCCAAAGTGGAAGATCATTGACTTGATCTGCACCTTGGTCTTCTCTGTCATCGTCTTGGGAACCACCATCAATATGATCAGAAGTATTCTTGAGGTCTTGATGGAGAGTACCCCAAGAGAAATCGACGCCACCAAGCTTGAGAAGGGTCTTCTTGAGATGGAGGAGGTCGTCGCTGTTCACGAATTGCACATCTGGGCCTCTACCGTTGGTAAGGTCTTGCTTGCTTGCCATGTCAACGCCAGACCAGATGCCGATGCCGATATGGTCCTTAACAAAGTCGTTGACTATATTAGGAGAGAATATAACATTTCTCATGTTACTATCCAAATTGAAAGATAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGAGAGACC

GGTCTCACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTAGAGACC

2019.6.1 ~ 6.10

Construction plasmids：

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

We insert promoter TEF1 and terminator CYC1, promoter GPM1 and terminator TDH1, promoter TDH3 and terminator PGK1, promoter TEF2 and terminator ENO2 into vector pSB1C3 using restriction endonuclease and T4 DNA ligase, respectively.

The pSB1C3 digestion system we used:

pSB1C3 15 μL
EcoRI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer 5 μL
ddH2O 24 μL


The enzyme system we use:

pSB1C3 2 μL
fragment 6 μL
T4 DNA Ligase 0.5 μL
T4 Buffer 1 μL
ddH2O 0.5 μL

BBa_k3126001:

BBa_k3126002:

BBa_k3126003:

BBa_k3126004:

2019.6.10 ~ 6.20

Construction plasmids：

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGAGATTCCCTAGTATCTTCACCGCCGTCTTGTTCGCTGCTAGTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACCACCGAAGACGAAACCGCTCAGATCCCAGCTGAAGCCGTCATCGGTTACCTTGACCTTGAGGGTGACTTCGATGTCGCCGTCCTTCCATTCTCTAACAGTACCAACAACGGTCTTTTGTTCATTAACACCACCATTGCTTCTATCGCCGCTAAGGAGGAGGGTGTCTCTCTTGACAAGAGACATCACCACCACCATCACAGTGCTAAGTCTAGTTTCATCTCTACCACCACTACCGACCTTACCTCTATCAACACCAGTGCCTACAGTACCGGTTCTATCTCTACCGTCGAAACCGGAAACAGAACCACCTCTGAGGTCATCTCTCATGTCGTCACCACCTCTACCAAGCTTAGTCCTACCGCCACCACCAGTCTTACCATCGCTCAAACTTCTATTTATAGTACCGACTCTAATATTACCGTCGGTACCGACATCCACACCACCAGTGAAGTCATCTCTGACGTCGAAACCATCTCTAGGGAAACCGCCTCTACCGTTGTTGCCGCCCCAACTTCTACCACTGGTTGGACCGGTGCCATGAACACTTACATCTCTCAATTCACTTCTTCTAGTTTTGCTACTATTAACTCTACCCCTATCATCTCTTCTAGTGCCGTCTTCGAAACCAGTGACGCCTCTATCGTCAACGTCCATACCGAGAACATCACCAACACTGCTGCCGTTCCATCTGAGGAGCCTACCTTCGTCAACGCCACTAGAAACTCTCTTAATTCTTTTTGTTCTTCTAAACAACCATCTTCTCCTAGTTCTTATACTTCTTCTCCTTTGGTTTCTTCTTTGTCTGTTTCTAAGACCTTGTTGTCTACCTCTTTCACCCCTTCTGTCCCAACTTCTAATACTTATATTAAGACCAAGAACACTGGTTACTTCGAGCACACTGCCTTGACCACCTCTAGTGTTGGATTGAATAGTTTCTCTGAAACCGCCGTCTCTAGTCAAGGTACCAAGATTGACACCTTTTTGGTTTCTAGTTTGATCGCCTACCCATCTTCTGCCTCTGGTTCTCAGCTTAGTGGTATCCAGCAAAATTTTACCTCTACTTCTTTGATGATCAGTACCTACGAGGGTAAGGCCAGTATCTTCTTCTCTGCCGAGTTGGGTTCTATTATTTTTTTGTTGCTTAGTTATTTGTTGTTTTAAAACGGGTACTGTACAGTTAGTACATTGAGTCGAAATATACGAAATTATTGTTCATAATTTTCATCCTGGCTCTTTTTTTCTTCAACCATAGTTAAATGGACAGTTCATATCTTAACTCTAATAATACTTTTCTAGTTCTTATCCTTTTCCGTCTCACCGCAGATTTTATCATAGTATTAAATTTATATTTTGTTCGTAAAAAGAAAAATTTGTGAGCGTTACCGCTCGTTTCATTACCCGAAGGCTGTTTCAGTAGACCACTGATTAAGTAAGTAGATGAAAAAATTTCATCACCATGAAAGAGTTCGATGAGAGCTACTTTTTCAAATGCTTAACAGCTAACCGCCATTCAATAATGTTACGCTCTCTTCATTCTGCGGCTACGTTATCTAACAAGAGGTTTTACTCTCTCATATCTCATTCAAATAGAAAGAACATAATCAAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATGATTAAGTACCATGTCATGAAAGAAGGTTACATCTTGACTGTTTTTAAAAATGAAAGGTTGAGTTGGTTGCCATATATCGCCATCGTCATTTTGTTGCACGTTATTGGTTTCTCTTTCTTGTGGATCGCCGGTAAGGACCATCACATTTTGTTCGGTATGGGTATCCTTGCCTACACTCTTGGTTTGAGGCATGCCTTTGATGCCGACCATATCGCCGCTATCGACAACACCGTTAGAAAGTTGTTGCAGCAGAGAAAGGACCCATCTGGTGTCGGTTTCTACTTCTCTATTGGACATTCTTCTGTCGTCTTCTTGATGGCCGTTTTCCTTGGTGTCTCTGTCAAGTGGGCCAAGGACGAACTTCCTCACTTCCAAGATATCGGAGGTACCATTGGAACCCTTGTTTCTGGTTTTTTCTTGGTTCTTATTGGAGTTCTTAATCTTATTATTCTTATTTCTTTGATTAACTTGTTCGCCAAGTTGAGGAGGGAACACATCGAAGAAGCTGAGGTCGATGCCTTGTTGGAGTCTAGGGGTCTTGTCTCTAGGTTCGTCGGACCATACTTTAAGTTGATCACCAGAAGTTGGCACGTCTTGCCTCTTGGATTCCTTTTCGGATTGGGATTCGACACCGCTTCTGAGATCGCCTTGCTTGCCCTTAGTAGTGGAGCCTCTCAGCAAGCTATCTCTTTCATTGGTATTTTGTCTTTGCCTATCTTGTTCGCCAGTGGTATGAGTCTTCTTGACACCCTTGACGGTGTCGTCATGAAGTACGCCTACAACTGGGCCTTCTTCAACCCTATCAGAAAAATCTATTACAACATTACCATTACCGCCATCTCTGTTATGGCCGCCCTTGTTATCGGTATGATCGAATTGCTTCAAATTCTTGCCGACAAACTTGACTTGCATGGAGCCTTCTGGGCCTTCATTGGAAGTATCGAGTTCGATTATTTGGGTTATATCTTGGTTGCCTTGTTTCTTATTACTTGGTTGATCAGTTCTTTGATTTGGAAATTTGGAAGAATTGAACACAAATGGAGTAGATAAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATGGAGAGTTCTTCTCATATTATTGAAGTCAACGGAGGTAGATCTGACGAGGAAAGAAGGGCTGTCGCTAGTAAGGTCTGCGGAGAAGCTCCTTGCGGTTTCAGTGACGCTAAGAACGCTTCTGGTGACGCCCAAGAAAGGAACGCCTCTATGAGGAAATTGTGCATCGCCGTCGTCTTGTGCCTTGTCTTCATGTCTGTCGAGGTCGTTGGTGGTGTCAAGGCCAACAGTTTGGCCATCATGACCGATGCCGCTCATCTTTTGAGTGACGTTGCCGCTTTCGCCATCTCTTTGTTCAGTCTTTGGGCTGCCGGTTGGGAGGCTACCCCAAGGCACACCTACGGATTCTTCAGAATCGAAATTCTTGGAGCTCTTGTTTCTATCCAATTGATTTGGTTGCTTACTGGTATCCTTGTTTACGAGGCCATCATTAGACTTTTGACCGAAACCTCTGAGGTCAACGGTTTCTTGATGTTCGCTGTCGCCACTTTCGGTTTGCTTGTCAACATTATCATGGCTGTCATGCTTGGTCACGACCATGACAATGGTCACGGTCATAGTCACGGTGAGGACAAACACGATGAAGCCCATGGTGACGTCACTGAACAGCTTCTTGAAAAGCCAAAACAGCAGAAGGAAAAAAAGAAGAGGAACATCAACGCCCAAGGTGCCTATTTGCACGTCTTGGGTGACTCTATCCAGTCTGTCGGAGTCATGATCGGTGGTGCTGCTATCTGGTACAATCCAAAGTGGAAGATCATTGACTTGATCTGCACCTTGGTCTTCTCTGTCATCGTCTTGGGAACCACCATCAATATGATCAGAAGTATTCTTGAGGTCTTGATGGAGAGTACCCCAAGAGAAATCGACGCCACCAAGCTTGAGAAGGGTCTTCTTGAGATGGAGGAGGTCGTCGCTGTTCACGAATTGCACATCTGGGCCTCTACCGTTGGTAAGGTCTTGCTTGCTTGCCATGTCAACGCCAGACCAGATGCCGATGCCGATATGGTCCTTAACAAAGTCGTTGACTATATTAGGAGAGAATATAACATTTCTCATGTTACTATCCAAATTGAAAGATAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

Insertion of gene into plasmid carrying promoter and terminator.

BBa_K3126005 (pSB1C3-pTEF1/ tCYC1/ hexa His):

Enzyme digestion system:

BBa_K312600120 μL
BamHI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O22 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126001 2 μL
hexa-His4 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

BBa_K3126006 (pSB1C3-pGPM1/tTDH1/ nixA):

Enzyme digestion system:

BBa_K312600220 μL
BamHI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O22 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126002 2 μL
nixA4 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

BBa_K3126007 (pSB1C3-pTDH3/tPGK1/ TgMTP1t2):

Enzyme digestion system:

BBa_K312600320 μL
BamHI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O22 μL

Seamless cloning system:

BBa__K3126003 2 μL
TgMTP1t24 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

BBa_K3126008 (pSB1C3-pTEF2/tENO2/ kanR):

Enzyme digestion system:

BBa_K312600320 μL
BamHI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O22 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126004 2 μL
kanR4 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

2019.6.20 ~ 6.30

Construction of plasmids for the translation and expression of genes in S. cerevisiae:

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGAGATTCCCTAGTATCTTCACCGCCGTCTTGTTCGCTGCTAGTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACCACCGAAGACGAAACCGCTCAGATCCCAGCTGAAGCCGTCATCGGTTACCTTGACCTTGAGGGTGACTTCGATGTCGCCGTCCTTCCATTCTCTAACAGTACCAACAACGGTCTTTTGTTCATTAACACCACCATTGCTTCTATCGCCGCTAAGGAGGAGGGTGTCTCTCTTGACAAGAGACATCACCACCACCATCACAGTGCTAAGTCTAGTTTCATCTCTACCACCACTACCGACCTTACCTCTATCAACACCAGTGCCTACAGTACCGGTTCTATCTCTACCGTCGAAACCGGAAACAGAACCACCTCTGAGGTCATCTCTCATGTCGTCACCACCTCTACCAAGCTTAGTCCTACCGCCACCACCAGTCTTACCATCGCTCAAACTTCTATTTATAGTACCGACTCTAATATTACCGTCGGTACCGACATCCACACCACCAGTGAAGTCATCTCTGACGTCGAAACCATCTCTAGGGAAACCGCCTCTACCGTTGTTGCCGCCCCAACTTCTACCACTGGTTGGACCGGTGCCATGAACACTTACATCTCTCAATTCACTTCTTCTAGTTTTGCTACTATTAACTCTACCCCTATCATCTCTTCTAGTGCCGTCTTCGAAACCAGTGACGCCTCTATCGTCAACGTCCATACCGAGAACATCACCAACACTGCTGCCGTTCCATCTGAGGAGCCTACCTTCGTCAACGCCACTAGAAACTCTCTTAATTCTTTTTGTTCTTCTAAACAACCATCTTCTCCTAGTTCTTATACTTCTTCTCCTTTGGTTTCTTCTTTGTCTGTTTCTAAGACCTTGTTGTCTACCTCTTTCACCCCTTCTGTCCCAACTTCTAATACTTATATTAAGACCAAGAACACTGGTTACTTCGAGCACACTGCCTTGACCACCTCTAGTGTTGGATTGAATAGTTTCTCTGAAACCGCCGTCTCTAGTCAAGGTACCAAGATTGACACCTTTTTGGTTTCTAGTTTGATCGCCTACCCATCTTCTGCCTCTGGTTCTCAGCTTAGTGGTATCCAGCAAAATTTTACCTCTACTTCTTTGATGATCAGTACCTACGAGGGTAAGGCCAGTATCTTCTTCTCTGCCGAGTTGGGTTCTATTATTTTTTTGTTGCTTAGTTATTTGTTGTTTTAAAACGGGTACTGTACAGTTAGTACATTGAGTCGAAATATACGAAATTATTGTTCATAATTTTCATCCTGGCTCTTTTTTTCTTCAACCATAGTTAAATGGACAGTTCATATCTTAACTCTAATAATACTTTTCTAGTTCTTATCCTTTTCCGTCTCACCGCAGATTTTATCATAGTATTAAATTTATATTTTGTTCGTAAAAAGAAAAATTTGTGAGCGTTACCGCTCGTTTCATTACCCGAAGGCTGTTTCAGTAGACCACTGATTAAGTAAGTAGATGAAAAAATTTCATCACCATGAAAGAGTTCGATGAGAGCTACTTTTTCAAATGCTTAACAGCTAACCGCCATTCAATAATGTTACGCTCTCTTCATTCTGCGGCTACGTTATCTAACAAGAGGTTTTACTCTCTCATATCTCATTCAAATAGAAAGAACATAATCAAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGCCTTACTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAA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GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATGATTAAGTACCATGTCATGAAAGAAGGTTACATCTTGACTGTTTTTAAAAATGAAAGGTTGAGTTGGTTGCCATATATCGCCATCGTCATTTTGTTGCACGTTATTGGTTTCTCTTTCTTGTGGATCGCCGGTAAGGACCATCACATTTTGTTCGGTATGGGTATCCTTGCCTACACTCTTGGTTTGAGGCATGCCTTTGATGCCGACCATATCGCCGCTATCGACAACACCGTTAGAAAGTTGTTGCAGCAGAGAAAGGACCCATCTGGTGTCGGTTTCTACTTCTCTATTGGACATTCTTCTGTCGTCTTCTTGATGGCCGTTTTCCTTGGTGTCTCTGTCAAGTGGGCCAAGGACGAACTTCCTCACTTCCAAGATATCGGAGGTACCATTGGAACCCTTGTTTCTGGTTTTTTCTTGGTTCTTATTGGAGTTCTTAATCTTATTATTCTTATTTCTTTGATTAACTTGTTCGCCAAGTTGAGGAGGGAACACATCGAAGAAGCTGAGGTCGATGCCTTGTTGGAGTCTAGGGGTCTTGTCTCTAGGTTCGTCGGACCATACTTTAAGTTGATCACCAGAAGTTGGCACGTCTTGCCTCTTGGATTCCTTTTCGGATTGGGATTCGACACCGCTTCTGAGATCGCCTTGCTTGCCCTTAGTAGTGGAGCCTCTCAGCAAGCTATCTCTTTCATTGGTATTTTGTCTTTGCCTATCTTGTTCGCCAGTGGTATGAGTCTTCTTGACACCCTTGACGGTGTCGTCATGAAGTACGCCTACAACTGGGCCTTCTTCAACCCTATCAGAAAAATCTATTACAACATTACCATTACCGCCATCTCTGTTATGGCCGCCCTTGTTATCGGTATGATCGAATTGCTTCAAATTCTTGCCGACAAACTTGACTTGCATGGAGCCTTCTGGGCCTTCATTGGAAGTATCGAGTTCGATTATTTGGGTTATATCTTGGTTGCCTTGTTTCTTATTACTTGGTTGATCAGTTCTTTGATTTGGAAATTTGGAAGAATTGAACACAAATGGAGTAGATAAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCCTTACTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATGGAGAGTTCTTCTCATATTATTGAAGTCAACGGAGGTAGATCTGACGAGGAAAGAAGGGCTGTCGCTAGTAAGGTCTGCGGAGAAGCTCCTTGCGGTTTCAGTGACGCTAAGAACGCTTCTGGTGACGCCCAAGAAAGGAACGCCTCTATGAGGAAATTGTGCATCGCCGTCGTCTTGTGCCTTGTCTTCATGTCTGTCGAGGTCGTTGGTGGTGTCAAGGCCAACAGTTTGGCCATCATGACCGATGCCGCTCATCTTTTGAGTGACGTTGCCGCTTTCGCCATCTCTTTGTTCAGTCTTTGGGCTGCCGGTTGGGAGGCTACCCCAAGGCACACCTACGGATTCTTCAGAATCGAAATTCTTGGAGCTCTTGTTTCTATCCAATTGATTTGGTTGCTTACTGGTATCCTTGTTTACGAGGCCATCATTAGACTTTTGACCGAAACCTCTGAGGTCAACGGTTTCTTGATGTTCGCTGTCGCCACTTTCGGTTTGCTTGTCAACATTATCATGGCTGTCATGCTTGGTCACGACCATGACAATGGTCACGGTCATAGTCACGGTGAGGACAAACACGATGAAGCCCATGGTGACGTCACTGAACAGCTTCTTGAAAAGCCAAAACAGCAGAAGGAAAAAAAGAAGAGGAACATCAACGCCCAAGGTGCCTATTTGCACGTCTTGGGTGACTCTATCCAGTCTGTCGGAGTCATGATCGGTGGTGCTGCTATCTGGTACAATCCAAAGTGGAAGATCATTGACTTGATCTGCACCTTGGTCTTCTCTGTCATCGTCTTGGGAACCACCATCAATATGATCAGAAGTATTCTTGAGGTCTTGATGGAGAGTACCCCAAGAGAAATCGACGCCACCAAGCTTGAGAAGGGTCTTCTTGAGATGGAGGAGGTCGTCGCTGTTCACGAATTGCACATCTGGGCCTCTACCGTTGGTAAGGTCTTGCTTGCTTGCCATGTCAACGCCAGACCAGATGCCGATGCCGATATGGTCCTTAACAAAGTCGTTGACTATATTAGGAGAGAATATAACATTTCTCATGTTACTATCCAAATTGAAAGATAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

The resistance gene(kanR) was linked to the target gene(hexa-His, nixA, TgMTP1t2) to screen the engineering yeast and the original yeast.

BBa_K3126009 (pSB1C3-pTEF1/ tCYC1/ hexa-His/ kanR):

Enzyme digestion system:

BBa_K312600525 μL
SpeI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

BBa_K312600825 μL
XbaI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

The enzyme system we use:

BBa_K3126005 linear plasmid 2 μL
kanR part6 μL
T4 DNA Ligase0.5 μL
T4Buffer1 μL
ddH2O0.5 μL

BBa_K3126010 (pSB1C3-pGPM1/tTDH1/ nixA/ kanR)

Enzyme digestion system:

BBa_K312600625 μL
SpeI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

BBa_K312600825 μL
XbaI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

The enzyme system we use:

BBa_K3126006 linear plasmid 2 μL
kanR part4 μL
T4 DNA Ligase0.5 μL
T4Buffer1 μL
ddH2O0.5 μL

BBa_K3126011 (pSB1C3-pTDH3/tPGK1/ TgMTP1t2/ kanR)

Enzyme digestion system:

BBa_K312600725 μL
SpeI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

BBa_K312600825 μL
XbaI 3 μL
PstI 3 μL
Cutsmart Buffer5 μL
ddH2O14 μL

The enzyme system we use:

BBa_K3126007 linear plasmid 2 μL
kanR part4 μL
T4 DNA Ligase0.5 μL
T4Buffer1 μL
ddH2O0.5 μL

2019.7.1 ~ 7.10

Construction of plasmids for the translation and expression of genes in S. cerevisiae:

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGAGATTCCCTAGTATCTTCACCGCCGTCTTGTTCGCTGCTAGTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACCACCGAAGACGAAACCGCTCAGATCCCAGCTGAAGCCGTCATCGGTTACCTTGACCTTGAGGGTGACTTCGATGTCGCCGTCCTTCCATTCTCTAACAGTACCAACAACGGTCTTTTGTTCATTAACACCACCATTGCTTCTATCGCCGCTAAGGAGGAGGGTGTCTCTCTTGACAAGAGACATCACCACCACCATCACAGTGCTAAGTCTAGTTTCATCTCTACCACCACTACCGACCTTACCTCTATCAACACCAGTGCCTACAGTACCGGTTCTATCTCTACCGTCGAAACCGGAAACAGAACCACCTCTGAGGTCATCTCTCATGTCGTCACCACCTCTACCAAGCTTAGTCCTACCGCCACCACCAGTCTTACCATCGCTCAAACTTCTATTTATAGTACCGACTCTAATATTACCGTCGGTACCGACATCCACACCACCAGTGAAGTCATCTCTGACGTCGAAACCATCTCTAGGGAAACCGCCTCTACCGTTGTTGCCGCCCCAACTTCTACCACTGGTTGGACCGGTGCCATGAACACTTACATCTCTCAATTCACTTCTTCTAGTTTTGCTACTATTAACTCTACCCCTATCATCTCTTCTAGTGCCGTCTTCGAAACCAGTGACGCCTCTATCGTCAACGTCCATACCGAGAACATCACCAACACTGCTGCCGTTCCATCTGAGGAGCCTACCTTCGTCAACGCCACTAGAAACTCTCTTAATTCTTTTTGTTCTTCTAAACAACCATCTTCTCCTAGTTCTTATACTTCTTCTCCTTTGGTTTCTTCTTTGTCTGTTTCTAAGACCTTGTTGTCTACCTCTTTCACCCCTTCTGTCCCAACTTCTAATACTTATATTAAGACCAAGAACACTGGTTACTTCGAGCACACTGCCTTGACCACCTCTAGTGTTGGATTGAATAGTTTCTCTGAAACCGCCGTCTCTAGTCAAGGTACCAAGATTGACACCTTTTTGGTTTCTAGTTTGATCGCCTACCCATCTTCTGCCTCTGGTTCTCAGCTTAGTGGTATCCAGCAAAATTTTACCTCTACTTCTTTGATGATCAGTACCTACGAGGGTAAGGCCAGTATCTTCTTCTCTGCCGAGTTGGGTTCTATTATTTTTTTGTTGCTTAGTTATTTGTTGTTTTAAAACGGGTACTGTACAGTTAGTACATTGAGTCGAAATATACGAAATTATTGTTCATAATTTTCATCCTGGCTCTTTTTTTCTTCAACCATAGTTAAATGGACAGTTCATATCTTAACTCTAATAATACTTTTCTAGTTCTTATCCTTTTCCGTCTCACCGCAGATTTTATCATAGTATTAAATTTATATTTTGTTCGTAAAAAGAAAAATTTGTGAGCGTTACCGCTCGTTTCATTACCCGAAGGCTGTTTCAGTAGACCACTGATTAAGTAAGTAGATGAAAAAATTTCATCACCATGAAAGAGTTCGATGAGAGCTACTTTTTCAAATGCTTAACAGCTAACCGCCATTCAATAATGTTACGCTCTCTTCATTCTGCGGCTACGTTATCTAACAAGAGGTTTTACTCTCTCATATCTCATTCAAATAGAAAGAACATAATCAAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGT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GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATGATTAAGTACCATGTCATGAAAGAAGGTTACATCTTGACTGTTTTTAAAAATGAAAGGTTGAGTTGGTTGCCATATATCGCCATCGTCATTTTGTTGCACGTTATTGGTTTCTCTTTCTTGTGGATCGCCGGTAAGGACCATCACATTTTGTTCGGTATGGGTATCCTTGCCTACACTCTTGGTTTGAGGCATGCCTTTGATGCCGACCATATCGCCGCTATCGACAACACCGTTAGAAAGTTGTTGCAGCAGAGAAAGGACCCATCTGGTGTCGGTTTCTACTTCTCTATTGGACATTCTTCTGTCGTCTTCTTGATGGCCGTTTTCCTTGGTGTCTCTGTCAAGTGGGCCAAGGACGAACTTCCTCACTTCCAAGATATCGGAGGTACCATTGGAACCCTTGTTTCTGGTTTTTTCTTGGTTCTTATTGGAGTTCTTAATCTTATTATTCTTATTTCTTTGATTAACTTGTTCGCCAAGTTGAGGAGGGAACACATCGAAGAAGCTGAGGTCGATGCCTTGTTGGAGTCTAGGGGTCTTGTCTCTAGGTTCGTCGGACCATACTTTAAGTTGATCACCAGAAGTTGGCACGTCTTGCCTCTTGGATTCCTTTTCGGATTGGGATTCGACACCGCTTCTGAGATCGCCTTGCTTGCCCTTAGTAGTGGAGCCTCTCAGCAAGCTATCTCTTTCATTGGTATTTTGTCTTTGCCTATCTTGTTCGCCAGTGGTATGAGTCTTCTTGACACCCTTGACGGTGTCGTCATGAAGTACGCCTACAACTGGGCCTTCTTCAACCCTATCAGAAAAATCTATTACAACATTACCATTACCGCCATCTCTGTTATGGCCGCCCTTGTTATCGGTATGATCGAATTGCTTCAAATTCTTGCCGACAAACTTGACTTGCATGGAGCCTTCTGGGCCTTCATTGGAAGTATCGAGTTCGATTATTTGGGTTATATCTTGGTTGCCTTGTTTCTTATTACTTGGTTGATCAGTTCTTTGATTTGGAAATTTGGAAGAATTGAACACAAATGGAGTAGATAAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATGGAGAGTTCTTCTCATATTATTGAAGTCAACGGAGGTAGATCTGACGAGGAAAGAAGGGCTGTCGCTAGTAAGGTCTGCGGAGAAGCTCCTTGCGGTTTCAGTGACGCTAAGAACGCTTCTGGTGACGCCCAAGAAAGGAACGCCTCTATGAGGAAATTGTGCATCGCCGTCGTCTTGTGCCTTGTCTTCATGTCTGTCGAGGTCGTTGGTGGTGTCAAGGCCAACAGTTTGGCCATCATGACCGATGCCGCTCATCTTTTGAGTGACGTTGCCGCTTTCGCCATCTCTTTGTTCAGTCTTTGGGCTGCCGGTTGGGAGGCTACCCCAAGGCACACCTACGGATTCTTCAGAATCGAAATTCTTGGAGCTCTTGTTTCTATCCAATTGATTTGGTTGCTTACTGGTATCCTTGTTTACGAGGCCATCATTAGACTTTTGACCGAAACCTCTGAGGTCAACGGTTTCTTGATGTTCGCTGTCGCCACTTTCGGTTTGCTTGTCAACATTATCATGGCTGTCATGCTTGGTCACGACCATGACAATGGTCACGGTCATAGTCACGGTGAGGACAAACACGATGAAGCCCATGGTGACGTCACTGAACAGCTTCTTGAAAAGCCAAAACAGCAGAAGGAAAAAAAGAAGAGGAACATCAACGCCCAAGGTGCCTATTTGCACGTCTTGGGTGACTCTATCCAGTCTGTCGGAGTCATGATCGGTGGTGCTGCTATCTGGTACAATCCAAAGTGGAAGATCATTGACTTGATCTGCACCTTGGTCTTCTCTGTCATCGTCTTGGGAACCACCATCAATATGATCAGAAGTATTCTTGAGGTCTTGATGGAGAGTACCCCAAGAGAAATCGACGCCACCAAGCTTGAGAAGGGTCTTCTTGAGATGGAGGAGGTCGTCGCTGTTCACGAATTGCACATCTGGGCCTCTACCGTTGGTAAGGTCTTGCTTGCTTGCCATGTCAACGCCAGACCAGATGCCGATGCCGATATGGTCCTTAACAAAGTCGTTGACTATATTAGGAGAGAATATAACATTTCTCATGTTACTATCCAAATTGAAAGATAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

GTCCGGCAAAAAAGGGCAAGGTGTCACCACCCTGCCCTTTTTCTTTAAAACCGAAAAGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCTCGAGGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCGATATCAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCCGATCAACTCGAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGGGTCTCATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCCCTTGCCAACAGGGAGTTCTTCAGAGACATGGAGGCTCAAAACGAAATTATTGACAGCCTAGACATCAATAGTCATACAACAGAAAGCGACCACCCAACTTTGGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTACGTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACATATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGACCGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGACACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTTTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCATCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAGGATCCATGAGATTCCCTAGTATCTTCACCGCCGTCTTGTTCGCTGCTAGTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACCACCGAAGACGAAACCGCTCAGATCCCAGCTGAAGCCGTCATCGGTTACCTTGACCTTGAGGGTGACTTCGATGTCGCCGTCCTTCCATTCTCTAACAGTACCAACAACGGTCTTTTGTTCATTAACACCACCATTGCTTCTATCGCCGCTAAGGAGGAGGGTGTCTCTCTTGACAAGAGACATCACCACCACCATCACAGTGCTAAGTCTAGTTTCATCTCTACCACCACTACCGACCTTACCTCTATCAACACCAGTGCCTACAGTACCGGTTCTATCTCTACCGTCGAAACCGGAAACAGAACCACCTCTGAGGTCATCTCTCATGTCGTCACCACCTCTACCAAGCTTAGTCCTACCGCCACCACCAGTCTTACCATCGCTCAAACTTCTATTTATAGTACCGACTCTAATATTACCGTCGGTACCGACATCCACACCACCAGTGAAGTCATCTCTGACGTCGAAACCATCTCTAGGGAAACCGCCTCTACCGTTGTTGCCGCCCCAACTTCTACCACTGGTTGGACCGGTGCCATGAACACTTACATCTCTCAATTCACTTCTTCTAGTTTTGCTACTATTAACTCTACCCCTATCATCTCTTCTAGTGCCGTCTTCGAAACCAGTGACGCCTCTATCGTCAACGTCCATACCGAGAACATCACCAACACTGCTGCCGTTCCATCTGAGGAGCCTACCTTCGTCAACGCCACTAGAAACTCTCTTAATTCTTTTTGTTCTTCTAAACAACCATCTTCTCCTAGTTCTTATACTTCTTCTCCTTTGGTTTCTTCTTTGTCTGTTTCTAAGACCTTGTTGTCTACCTCTTTCACCCCTTCTGTCCCAACTTCTAATACTTATATTAAGACCAAGAACACTGGTTACTTCGAGCACACTGCCTTGACCACCTCTAGTGTTGGATTGAATAGTTTCTCTGAAACCGCCGTCTCTAGTCAAGGTACCAAGATTGACACCTTTTTGGTTTCTAGTTTGATCGCCTACCCATCTTCTGCCTCTGGTTCTCAGCTTAGTGGTATCCAGCAAAATTTTACCTCTACTTCTTTGATGATCAGTACCTACGAGGGTAAGGCCAGTATCTTCTTCTCTGCCGAGTTGGGTTCTATTATTTTTTTGTTGCTTAGTTATTTGTTGTTTTAAAACGGGTACTGTACAGTTAGTACATTGAGTCGAAATATACGAAATTATTGTTCATAATTTTCATCCTGGCTCTTTTTTTCTTCAACCATAGTTAAATGGACAGTTCATATCTTAACTCTAATAATACTTTTCTAGTTCTTATCCTTTTCCGTCTCACCGCAGATTTTATCATAGTATTAAATTTATATTTTGTTCGTAAAAAGAAAAATTTGTGAGCGTTACCGCTCGTTTCATTACCCGAAGGCTGTTTCAGTAGACCACTGATTAAGTAAGTAGATGAAAAAATTTCATCACCATGAAAGAGTTCGATGAGAGCTACTTTTTCAAATGCTTAACAGCTAACCGCCATTCAATAATGTTACGCTCTCTTCATTCTGCGGCTACGTTATCTAACAAGAGGTTTTACTCTCTCATATCTCATTCAAATAGAAAGAACATAATCAAAAGGATCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGGGCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCCACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAACACACATATTACAATAGGATCCATGATTAAGTACCATGTCATGAAAGAAGGTTACATCTTGACTGTTTTTAAAAATGAAAGGTTGAGTTGGTTGCCATATATCGCCATCGTCATTTTGTTGCACGTTATTGGTTTCTCTTTCTTGTGGATCGCCGGTAAGGACCATCACATTTTGTTCGGTATGGGTATCCTTGCCTACACTCTTGGTTTGAGGCATGCCTTTGATGCCGACCATATCGCCGCTATCGACAACACCGTTAGAAAGTTGTTGCAGCAGAGAAAGGACCCATCTGGTGTCGGTTTCTACTTCTCTATTGGACATTCTTCTGTCGTCTTCTTGATGGCCGTTTTCCTTGGTGTCTCTGTCAAGTGGGCCAAGGACGAACTTCCTCACTTCCAAGATATCGGAGGTACCATTGGAACCCTTGTTTCTGGTTTTTTCTTGGTTCTTATTGGAGTTCTTAATCTTATTATTCTTATTTCTTTGATTAACTTGTTCGCCAAGTTGAGGAGGGAACACATCGAAGAAGCTGAGGTCGATGCCTTGTTGGAGTCTAGGGGTCTTGTCTCTAGGTTCGTCGGACCATACTTTAAGTTGATCACCAGAAGTTGGCACGTCTTGCCTCTTGGATTCCTTTTCGGATTGGGATTCGACACCGCTTCTGAGATCGCCTTGCTTGCCCTTAGTAGTGGAGCCTCTCAGCAAGCTATCTCTTTCATTGGTATTTTGTCTTTGCCTATCTTGTTCGCCAGTGGTATGAGTCTTCTTGACACCCTTGACGGTGTCGTCATGAAGTACGCCTACAACTGGGCCTTCTTCAACCCTATCAGAAAAATCTATTACAACATTACCATTACCGCCATCTCTGTTATGGCCGCCCTTGTTATCGGTATGATCGAATTGCTTCAAATTCTTGCCGACAAACTTGACTTGCATGGAGCCTTCTGGGCCTTCATTGGAAGTATCGAGTTCGATTATTTGGGTTATATCTTGGTTGCCTTGTTTCTTATTACTTGGTTGATCAGTTCTTTGATTTGGAAATTTGGAAGAATTGAACACAAATGGAGTAGATAAGGATCCATAAAGCAATCTTGATGAGGATAATGATTTTTTTTTGAATATACATAAATACTACCGTTTTTCTGCTAGATTTTGTGATGACGTAAATAAGTACATATTACTTTTTAAGCCAAGACAAGATTAAGCATTAACTTTACCCTTTTCTTTCTAAGTTTCAATATTAGTTATCACTGTTTAAAAGTTATGGCGAGAACGTCGGCGGTTAAAATATATTACCCTGAACGAGGCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGATCCATGGAGAGTTCTTCTCATATTATTGAAGTCAACGGAGGTAGATCTGACGAGGAAAGAAGGGCTGTCGCTAGTAAGGTCTGCGGAGAAGCTCCTTGCGGTTTCAGTGACGCTAAGAACGCTTCTGGTGACGCCCAAGAAAGGAACGCCTCTATGAGGAAATTGTGCATCGCCGTCGTCTTGTGCCTTGTCTTCATGTCTGTCGAGGTCGTTGGTGGTGTCAAGGCCAACAGTTTGGCCATCATGACCGATGCCGCTCATCTTTTGAGTGACGTTGCCGCTTTCGCCATCTCTTTGTTCAGTCTTTGGGCTGCCGGTTGGGAGGCTACCCCAAGGCACACCTACGGATTCTTCAGAATCGAAATTCTTGGAGCTCTTGTTTCTATCCAATTGATTTGGTTGCTTACTGGTATCCTTGTTTACGAGGCCATCATTAGACTTTTGACCGAAACCTCTGAGGTCAACGGTTTCTTGATGTTCGCTGTCGCCACTTTCGGTTTGCTTGTCAACATTATCATGGCTGTCATGCTTGGTCACGACCATGACAATGGTCACGGTCATAGTCACGGTGAGGACAAACACGATGAAGCCCATGGTGACGTCACTGAACAGCTTCTTGAAAAGCCAAAACAGCAGAAGGAAAAAAAGAAGAGGAACATCAACGCCCAAGGTGCCTATTTGCACGTCTTGGGTGACTCTATCCAGTCTGTCGGAGTCATGATCGGTGGTGCTGCTATCTGGTACAATCCAAAGTGGAAGATCATTGACTTGATCTGCACCTTGGTCTTCTCTGTCATCGTCTTGGGAACCACCATCAATATGATCAGAAGTATTCTTGAGGTCTTGATGGAGAGTACCCCAAGAGAAATCGACGCCACCAAGCTTGAGAAGGGTCTTCTTGAGATGGAGGAGGTCGTCGCTGTTCACGAATTGCACATCTGGGCCTCTACCGTTGGTAAGGTCTTGCTTGCTTGCCATGTCAACGCCAGACCAGATGCCGATGCCGATATGGTCCTTAACAAAGTCGTTGACTATATTAGGAGAGAATATAACATTTCTCATGTTACTATCCAAATTGAAAGATAAGGATCCATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTAGGCCTTACTAGAGTTGATAGGTCAAGATCAATGTAAACAATTACTTTGTTATGTAGAGTTTTTTTAGCTACCTATATTCCACCATAACATCAATCATGCGGTTGCTGGTGTATTTACCAATAATGTTTAATGTATATATATATATATATATATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGATGTCAAGCGTAGGCGCTTCCCCTGCCGGCTGTGAGGGCGCCATAACCAAGGTATCTATAGACCGCCAATCAGCAAACTACCTCCGTACATTCATGTTGCACCCACACATTTATACACCCAGACCGCGACAAATTACCCATAAGGTTGTTTGTGACGGCGTCGTACAAGAGAACGTGGGAACTTTTTAGGCTCACCAAAAAAGAAAGAAAAAATACGAGTTGCTGACAGAAGCCTCAAGAAAAAAAAAATTCTTCTTCGACTATGCTGGAGGCAGAGATGATCGAGCCGGTAGTTAACTATATATAGCTAAATTGGTTCCATCACCTTCTTTTCTGGTGTCGCTCCTTCTAGTGCTATTTCTGGCTTTTCCTATTTTTTTTTTTCCATTTTTCTTTCTCTCTTTCTAATATATAAATTCTCTTGCATTTTCTATTTTTCTCTCTATCTATTCTACTTGTTTATTCCCTTCAAGGTTTTTTTTTAAGGAGTACTTGTTTTTAGAATATACGGTCAACGAACTATAATTAACTAAACGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGGGAAAGGAGAAGACCCACGTCAGTAGACCAAGGCTTAACAGTAACATGGACGCCGACTTGTACGGATACAAGTGGGCCAGAGACAACGTCGGTCAGTCTGGAGCTACCATCTATAGACTTTACGGAAAGCCAGACGCCCCAGAGTTGTTCCTTAAGCACGGTAAGGGATCTGTTGCCAACGACGTCACCGATGAGATGGTTAGACTTAACTGGCTTACCGAGTTCATGCCACTTCCAACCATCAAGCACTTCATTAGAACCCCAGATGACGCTTGGTTGTTGACCACTGCCATCCCCGGTAAGACCGCCTTTCAAGTTTTGGAAGAGTACCCAGACTCTGGAGAGAACATCGTTGACGCCTTGGCCGTCTTCCTTAGGAGGTTGCACTCTATCCCAGTTTGCAACTGCCCATTCAATAGTGATAGAGTCTTCAGACTTGCCCAAGCCCAGTCTAGGATGAACAACGGATTGGTCGATGCCTCTGACTTCGACGACGAGAGAAATGGATGGCCAGTCGAGCAAGTTTGGAAGGAGATGCATAAGCTTTTGCCTTTTTCTCCAGACAGTGTTGTCACCCACGGTGACTTTAGTTTGGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAATTGATCGGTTGCATCGACGTCGGTAGAGTTGGTATCGCCGATAGATACCAAGACTTGGCCATCTTGTGGAACTGCTTGGGTGAGTTCTCTCCAAGTCTTCAAAAAAGATTGTTCCAAAAATATGGTATTGACAACCCAGATATGAATAAATTGCAATTTCATTTGATGTTGGATGAGTTTTTCTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGTTTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTTTCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAAAAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGAGACCTACTAGTAGCGGCCGCTGCA

We obtained the fragments to be inserted by PCR, then combine several target genes by seamless cloning.

BBa_K3126012 (pSB1C3- hexa-His/ nixA/ kanR):

The PCR system of pGPM1-nixA-tTDH1:

(P-nixA-T_F

CGAAGGCTTTAATTTGCAGGGCCAAACTTTTCGGTTAACA

P-nixA-T_R

ACCTATCAACTCTAGTAAGGCCTCGTTCAGGGTAATATATTTT)

BBa_K3126006/SpeⅠ PstⅠ1 μL
P-nixA-T_F 2 μL
P-nixA-T_R2 μL
2×PCR mix20 μL
ddH2O15 μL

Enzyme digestion system:

BBa_K312600915 μL
StuI 3 μL
buffer 5 μL
ddH2O27 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126009/StuⅠ 2 μL
pGPM1-nixA-tTDH14 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

BBa_K3126013 (pSB1C3- nixA/ TgMTP1t2/ kanR)

The PCR system of pTDH3-TgMTP1t2-tPGK1

BBa_K3126007/SpeⅠ PstⅠ1 μL
P-TgMTP1t2-T_F2 μL
P-TgMTP1t2-T_R2 μL
2×PCR mix20 μL
ddH2O15 μL

Enzyme digestion system:

BBa_K312601015 μL
Stu>I 3 μL
buffer 5 μL
ddH2O27 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126010/StuⅠ 2 μL
pTDH3-TgMTP1t2-tPGK14 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

BBa_K3126014 (pSB1C3- hexa-His/ nixA/ TgMTP1t2/ kanR)

Enzyme digestion system:

BBa_K312601215 μL
StuI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O27 μL

Seamless cloning system:

BBa_K3126012/StuⅠ2 μL
pTDH3-TgMTP1t2-tPGK1 4 μL
5×CEⅡ Buffer2 μL
Exnase Ⅱ1 μL
ddH2O1 μL

2019.7.20 ~ 7.25

The plasmid is digested with Bsa1 to get the fragment to be integrated.

pSB1C3- hexa-His- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K312600925μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

pSB1C3-nixA- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K3126001025μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

pSB1C3-TgMTP1t2- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K3126001125μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

pSB1C3-hexa-His-nixA- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K3126001225μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

pSB1C3-nixA-TgMTP1t2- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K3126001325μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

pSB1C3-hexa-His-nixA-TgMTP1t2- kanR/ BsaⅠ

Enzyme digestion system:

BBa_K3126001425μL
BsaI 3 μL
buffer5 μL
ddH2O17 μL

2019.7.25 ~ 8.5

The fragments were transformed into S. cerevisiae to express the corresponding protein.

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